Oligonucleótidos que inhiben la expresión de la proteína OB-RGRP y procedimiento de detección de compuestos que modifican la interacción entre las proteínas de la familia de OB-RGRP y el receptor de la leptina.

Oligonucleótido opcionalmente modificado que comprende de 8 a 50 nucleótidos que hibrida de manera específica con la secuencia SEQ ID N° 1 e inhibe la expresión de OB-RGRP,

caracterizado porque comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos 90% con la secuencia SEQ ID NO:2.

Oligonucleótidos que inhiben la expresión de la proteína OB-RGRP y procedimiento de detección de compuestos que modifican la interacción entre las proteínas de la familia de OB-RGRP y el receptor de la leptina La presente solicitud tiene por objeto oligonucleótidos que inhiben la expresión de la proteína OB-RGRP

La invención se define por las reivindicaciones.

La leptina es una proteína de 16 kDa secretada principalmente por el tejido adiposo y se une a un receptor (OB-R) que pertenece a la familia de los receptores de las citoquinas. Se han identificado cinco isofermas de membrana de este receptor y derivan del corte y empalme alternativo de un mismo gen. Estas isofermas que poseen el mismo dominio extracelular y transmembrana, se caracterizan por dominios intracelulares de tamaños variables (Tartaglia et al. (1995) Ce1l83, 1263-1271) . También se ha identificado una forma soluble del receptor y proviene de un corte y empalme alternativo o de una escisión proteo lítica del dominio extracelular de las formas de membrana. La forma corta del receptor (OB-Rs) que parece implicada en el transporte de la leptina a través de la barrera hematoencefálica es la isoforma más expresada. La forma larga (OB-RI) sólo se expresa en algunos tejidos como el hipotálamo y parece responsable de la mayor parte de los efectos biológicos de la leptina (Sweeney, G. (2002) Cell Signal14, 655-663) . La leptina y su receptor han sido objeto de una atención particular a causa de su implicación en la regulación del equilibrio energético, del metabolismo y en la respuesta neuroendocrina a la ingesta alimentaria. Recientemente, se ha mostrado que la leptina también está implicada en funciones adicionales importantes como la regulación de la masa ósea, angiogénesis, cicatrización, formación de trombos, maduración sexual, hematopoyesis, regulación de la inmunidad y de la inflamación, desarrollo fetal y cáncer. La administración de leptina en organismos deficientes en leptina como los ratones (ob/ob) y determinados individuos humanos provoca una disminución de la masa de lipido en diversos tejidos como el higado y el tejido adiposo (Halaas et al. (1995) Science 269, 543546, Pelleymounter et al. (1995) Science 269, 540-543, Campfield et al. (1995) Science 269, 546-549, Farooqi et al. (1999) N Engl J Med 341, 879-884) . Este tratamiento con leptina también mejora la sensibilidad a la insulina y disminuye la masa grasa en el ratón y el ser humano que presentan una lipodistrofia (Shimomura et al. (1999) Nature 401, 73-76, Oral et al. (2002) New England Journal of Medicine 346, 570-578, Petersen et al. (2002) J Clin Invest 109, 1345-1350. Las personas obesas son generalmente resistentes a la leptina. Las razones de esta resistencia todavía se comprenden mal pero se han sugerido varios mecanismos: un defecto en el transporte de la leptina a través de la barrera hemato-encefálica, un defecto en la activación de los OB-R o de la señalización de estos receptores, y la sobreexpresión de reguladores negativos como SOCS3 y PTP-1 B Bjorbaek et al. (2000) J Biol Chem 275, 40649-40657, Cheng et al. (2002) Developmental Cell 2, 497-503, Cook y Unger (2002) Developmental Cell 2, 385-387. La comprensión de los mecanismos de la resistencia a la leptina requiere una caracterización más detallada de los mecanismos implicados en la activación de los OB-R.

El OB-R está asociado constitutivamente a la quinasa janus 2 (JAK2) . La unión de JAK2 al receptor es crítica para la señalización por los OB-R y se ha propuesto que está implicada en la estabilización de los dímeros de los receptores OB-R. La activación por agonistas provocará un cambio de conformación en la región yuxtamembrana de la cola citoplásmica de los OB-R. JAK2, que está constitutivamente unido al resto box1 en esta región se activa por autofosforilación y fosforila el receptor OB-RI pero no OB-Rs. La fosforilación de OB-RI permite el anclaje de proteínas STAT que se unen al receptor y se activan por fosforilación en tirosina. Las proteínas STAT activadas se dimerizan y translocan en el núcleo para estimular la transcripción de genes mediante el elemento de respuesta de STAT (Tartaglia (1997) J Biol Chem 272, 6093-6096) .

Recientemente, se ha descubierto un segundo promotor para el receptor de la leptina. De forma interesante, un segundo transcrito se co-expresa con los mensajeros de los OB-R a partir de este promotor. Este transcrito se ha observado en varias especies como el ratón, la rata, el ser humano, la levadura y C. elegans (Bailleul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25, 2752-2758) . Los experimentos de hibridación in situ confirman la co-expresión de los OB-R y del gen asociado en el cerebro de los ratones incluidas las regiones hipotalámicas implicadas en la regulación del peso corporal (Mercer et al., J Neuroendocrinol2000 Jul;12 (7) :649-55) . La proteina correspondiente está compuesta por 131 aminoácidos y se denomina proteína relacionada con el gen OB-R (OB-RGRP) . Esta proteína ha sido objeto de la solicitud de patente W098/05792.

Por otra parte, la solicitud de patente EP0969091 A2 enseña un polipéptido denominado LEPRGRP. Esta solicitud sugiere que la expresión del gen que codifica el polipéptido LEPRGRP endógeno podría ser inhibida por el sesgo de técnicas que bloquean la expresión.

El hecho de que OB-RGRP se exprese en la levadura y nematodo, organismos desprovistos de receptores de la leptina, indica un papel más general para OB-RGRP, apoyado por la deleción de esta proteína en la levadura que provoca un defecto en el transporte de proteinas del golgi hacia las vacuolas (Belgareh-Touze et al. (2002) Molecular Biology OfThe Ce1l13, 1694-1708) .

En 2001, un ADNc denominado MY047, se clonó a partir de una biblioteca de ADNc de cerebro humano (Huang et al. (2001) Blochimica et Biophysica acta. Gene structure and expression 327-331) . Esta proteina ha sido objeto además de la solicitud EP O 969 091. La función de la proteína correspondiente es todavía desconocida. MY047

tiene una homología del 68 % con OB-RGRP lo que sugiere que estas dos proteínas pertenecen a la misma familia. El análisis de las secuencias disponibles del proyecto de secuenciación del genoma humano muestra que no existe ningún otro homólogo.

Los solicitantes están vinculados a determinar el papel de la OB-RGRP y sus relaciones con los receptores de la leptina.

Así, han mostrado la especificidad de las interacciones entre la OB-RGRP y el receptor OBRs.

Además han mostrado que era posible modificar específicamente la expresión de los receptores de la leptina en la superficie celular mediante oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la proteína asociada al gen de los receptores de la leptina (OB-RGRP) .

La presente tiene por lo tanto por objeto oligonucleótidos opcionalmente modificados que comprenden de 8 a 50 nucleótidos que hibridan de manera específica con la secuencia SEO ID N° 1 e inhiben la expresión de OB-RGRP, caracterizados porque comprenden una secuencia que presenta una identidad de al menos 90% con la secuencia SEO ID NO:2. Ventajosamente, estos oligonucleótidos favorecen la expresión de los receptores de la leptina en la superficie celular.

Preferentemente, estos oligonucleótidos son antisentido.

Según un modo de aplicación ventajoso estos oligonucleótidos se caracterizan porque los nucleótidos están tioesterificados.

Según otro modo de aplicación ventajoso estos oligonucleótidos se caracterizan porque los nucleótidos están 2' 0metilados.

Según otro modo de aplicación ventajoso estos oligonucleótidos se caracterizan porque presentan un residuo trietilenglicol en sus extremos 3'.

Aunque la forma más usada de los compuestos antisentido se presenta en la forma de oligonucleétidos antisentido, la presente invención incluye los derivados de oligonucleótidos y los compuestos que mimetizan su estructura tales como los descritos más adelante, sin que esta lista sea limitativa. Los compuestos antisentido según esta invención comprenden preferentemente, de 8 a 50 nucleobases (es decir, son oligómeros formados por 8 a 50 unidades nucleotídicas) . Los compuestos antisentido particularmente considerados son los oligonucleótidos antisentido, más especialmente los que están formados por aproximadamente 12 a 30 nucleobases. Los compuestos antisentido comprenden ribozimas, oligozimas y otros ARN catalíticos cortos u oligonucleótidos catalíticos que hibridan con el ácido nucleico diana y modulan su expresión. Un nucleósido es... [Seguir leyendo]

1. Oligonucleótido opcionalmente modificado que comprende de 8 a 50 nucleótidos que hibrida de manera específica con la secuencia SEO ID N° 1 e inhibe la expresión de OB-RGRP, caracterizado porque comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos 90% con la secuencia SEO ID NO:2.

2. Oligonucleótido según la reivindicación 1 caracterizado porque favorece la expresión de los receptores de la leptina en la superficie celular.

3. Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque es un antisentido.

4. Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque los nucleótidos están tioesterificados.

5.0ligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque los nucleótidos están 2' 0metilados.

6. Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque presenta un residuo trietilenglicol en su extremo 3'.

7. Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque es monocatenario.

8. Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 7 en el que los nucleótidos en posiciones 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 Y 20, en el sentido 5' hacia 3', están tioesterificados.

9. Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 7 en el que los nucleótidos en posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 16, 17, 18, 19 Y 20, en el sentido 5' hacia 3', están 2' O-metilados.

10. Oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque es un AON.

11. Oligonucleótido de tipo Ácido Ribonucleico de Interferencia (ARNi) que comprende de 15 a 60 nucleótidos que hibrida de manera específica con la secuencia SEQ ID N° 21 e inhibe la expresión de OB-RGRP, caracterizado porque es un ARN bicatenario y porque al menos una de las dos cadenas comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos 90 'lo, con una de las secuencias SEO ID N° 37 o SEO IDo N 38.

12. Oligonucleótido de tipo Ácido Ribonucleico de Interferencia (ARNi) que comprende de 15 a 60 nucleótidos que hibrida de manera específica con la secuencia SEQ ID N° 21 e inhibe la expresión de OB-RGRP, caracterizado porque es un ARN monocatenario y porque comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos 90 %, con la secuencia SEQ ID N° 42.

13. Vector que expresa un oligonucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3, 11 Y 12.

14. Célula que contiene un vector según la reivindicación 13.