Cepas de levadura que producen colesterol y sus aplicaciones.

Cepa de levadura que produce de manera autónoma colesterol. a partir de una cepa de carbono simple,

caracterizada por que expresa las enzimas heterólogas 7-dehidrocolesterol reductasa y 3β -hidroxisterol L24reductasa, y por que la enzima estero.

Cepas de levadura que producen colesterol y sus aplicaciones

La presente invención se refiere a la producción de colesterol en organismos del reino de los hongos.

El colesterol (véase la figura 1) es el esterol animal más importante. Es un componente fundamental de las membranas celulares, de las que controla la fluidez, y está presente en todos los tejidos animales y especialmente en el tejido nervioso.

El colesterol es un producto de importante interés industrial. Así, se utiliza comúnmente en la industria cosmética. Se utiliza igualmente en la industria farmacéutica, por ejemplo en la administración de medicamentos («Drug deliver y ») , así como en cultivos celulares.

El colesterol se utiliza también en la síntesis industrial de la vitamina D3. Esta vitamina se utiliza para complementar los alimentos humanos (en los productos lácteos, por ejemplo) y animales. El colesterol se utiliza igualmente de forma ventajosa como aditivo en alimentos animales, principalmente en alimentos destinados a gambas de criadero.

Actualmente, la inmensa mayoría del colesterol comercializado se extrae a partir de tejido animal (una cantidad ínfima se produce por síntesis química) . Para la extracción del colesterol se utilizan dos fuentes principales: la médula espinal de bovinos y la lanolina que es la grasa natural de la lana de cordero.

La utilización de tejido animal como producto de partida presenta problemas. Así, los problemas recientes unidos a la transmisión del prión responsable de la tembladera de los corderos a los bovinos [enfermedad denominada en los bovinos encelopatía espongiforme bovina (BSE por sus iniciales en inglés: Bovine Spongiform Encephalopathy) ] han recordado la necesidad de prudencia durante la utilización de tejido animal como materia prima. Sin embargo, a pesar de las medidas tomadas, el riesgo de transmisión del agente patógeno no puede excluirse totalmente. Sería por lo tanto extremadamente ventajoso disponer de una fuente de colesterol que no provenga de un tejido animal.

Xu, S. et al (1988) describen una cepa de levadura que presenta una mutación del gen erg6 y en la que la enzima 24-C-metiltransferasa está inactivada. Esta levadura expresa las enzimas naturales 7-dehidrocolesterol reductasa y 3º-hidroxisterol L24-reductasa. Produce trazas de colesterol.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar una fuente de colesterol abundante y segura desde el punto de vista sanitario. Los inventores han mostrado de forma sorprendente que es posible desviar la producción natural de ergosterol en los hongos producir colesterol.

Descripción general de la invención

La invención se refiere a una cepa de levadura que produce de manera autónoma colesterol a partir de una cepa de carbono simple

caracterizada por que expresa las enzimas 7-dehidrocolesterol reductasa y 3º-hidroxisterol L24-reductasa y en la que la enzima esterol 24-C metiltransferasa se ha inactivado. Más particularmente, la invención se refiere a un organismo tal como se define anteriormente en el que la enzima C-22 esterol desaturasa ha sido además inactivada.

Otro aspecto de la invención se refiere a una cepa de levadura tal como se define anteriormente caracterizada por que la expresión de las enzimas 7-dehidrocolesterol reductasa y 3º-hidroxisterol A24-reductasa se obtiene por transformación del organismo.

La invención se refiere igualmente a un organismo del reino de los hongos tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque la desactivación de la enzima esterol 24-C-metiltransferasa se realiza por desactivación génica y/o la desactivación de la enzima C-22-esterol desaturasa se realiza por desactivación génica.

Otro aspecto de la invención se refiere a una cepa de levadura tal como se ha definido anteriormente, caracterizada porque se elige entre el filum Ascomycete, más especialmente entre el sub-filum Saccharomycotina, todavía más especialmente entre la clase Saccharomycetes o Schizosaccharomycetes, todavía más especialmente entre el orden Saccharomycetales o Schizosaccharomycetales, todavía más especialmente entre la familia Saccharomycetaceae o Schizosaccharomycetaceae, todavía más especialmente entre el género Saccharomyces o Schizosaccharomyces.

Otro aspecto de la invención se refiere a una levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de producción de colesterol de origen no animal que comprende el cultivo de un organismo tal como se ha definido anteriormente. Más especialmente, este procedimiento se caracteriza porque la etapa de cultivo del organismo es seguida por una etapa de extracción del colesterol. De forma preferida, la extracción del colesterol se realiza mediante un disolvente no miscible con el agua.

Más especialmente, el procedimiento tal como se ha definido anteriormente, se caracteriza porque se realiza una etapa de saponificación antes de la extracción del colesterol. Aún más especialmente, el procedimiento tal como se ha definido anteriormente se caracteriza porque se realiza una etapa de triturado mecánico de las células antes de la saponificación o la extracción del colesterol.

Otro aspecto de la invención se refiere a la utilización de una cepa de levadura tal como se ha definido anteriormente para la producción de colesterol o de uno de sus intermedios metabólicos o de una mezcla de esteroles marcada con 13C o con 14C.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de producción de colesterol o de uno de sus intermedios metabólicos o de una mezcla de esteroles marcada con 13C o con 14C que comprende las etapas siguientes:

. cultivo de un organismo del reino de los hongos tal como se ha definido anteriormente sobre un sustrato marcado con 13C o con 14C y,

. extracción de dicho colesterol, o de uno de sus intermedios metabólicos o de la mezcla de esteroles.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de fabricación de una mezcla isotópica de colesterol, de intermedios o de metabolitos de colesterol, marcados en diferentes posiciones mediante marcadores isotópicos, que comprende el cultivo de un organismo del reino de los hongos tal como se ha definido anteriormente sobre un sustrato marcado y luego sobre un sustrato no marcado, eligiéndose la duración del cultivo sobre cada uno de estos sustratos con el fin de obtener un perfil isotópico definido.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a la producción de colesterol en organismos del reino de los hongos. En los hongos, no se encuentra colesterol natural, siendo este último un esterol animal. El esterol mayoritario de las membranas celulares de estos organismos es el ergosterol.

La presente invención permite realizar la síntesis del colesterol, por la multiplicación de las levaduras, en presencia de una fuente de carbono sencilla. El método propuesto por la presente invención permite por lo tanto obtener una cantidad grande de colesterol, con un coste pequeño, ya que el procedimiento utiliza el cultivo de organismos del reino de los hongos y la adición de una fuente de carbono sencilla, fácilmente disponible en el comercio.

Por fuente de carbono sencilla, según la presente invención, se entienden las fuentes de carbono utilizables por el experto en la técnica para el crecimiento normal de una levadura. Se entiende designar principalmente los diferentes azúcares asimilables, tales como glucosa, galactosa o sacarosa, o las melazas, o los subproductos de estos azúcares. Una fuente de carbono sencilla muy particularmente preferida es el etanol y el glicerol.

El hecho de que la producción se realice de forma autónoma significa que no es necesario añadir sustratos para obtener el colesterol, sino que el organismo puede producirlo a partir únicamente de la fuente de carbono sencilla de partida. También está claro que la cepa puede producir el colesterol, mediante la utilización de un sustrato situado anteriormente en la vía metabólica, en la medida en que la cepa del organismo según la presente invención contenga todos los genes necesarios para la terminación de la vía metabólica de producción del colesterol.

La invención se refiere particularmente a una levadura genéticamente modificada... [Seguir leyendo]

1. Cepa de levadura que produce de manera autónoma colesterol. a partir de una cepa de carbono simple, caracterizada por que expresa las enzimas heterólogas 7-dehidrocolesterol reductasa y 3º -hidroxisterol L24

reductasa, y por que la enzima estero.

2. C-metiltransferasa se ha inactivado.

2. Cepa de levadura según la reivindicación 1 en la que la enzima C-22 esterol desaturasa se ha inactivado.

3. Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la expresión de las enzimas 7deshidrocolesterol reductasa y 3º-hidroxiesterol L24-reductasa se obtiene por transformación del organismo.

4. Cepa de levadura según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la desactivación de la enzima estero.

2. C-metiltransferasa se realiza por desactivación génica.

5. Cepa de levadura según la reivindicación 2 caracterizada por que la inactivación de la enzima C-22 esterol desaturasa se realiza por inactivación génica.

6. Cepa de levadura según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que se elige del género Saccharomyces o Schizosaccharomyces.

7. Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae caracterizada porque se trata de la cepa WGIF04 depositada ante la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) el 22 de abril de 2.004 con el número de registro I3203.

8. Procedimiento de producción de colesterol de origen no animal que comprende el cultivo de un organismo según una de las reivindicaciones precedentes.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la etapa de cultivo del organismo es seguida por una etapa de extracción del colesterol.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizada porque la extracción del colesterol se realiza con un disolvente no miscible con el agua.

11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque se realiza una etapa de saponificación antes de la extracción del colesterol.

12. Procedimiento según la reivindicación 9, 10 u 11, caracterizado porque se realiza una etapa de trituración mecánica de las células antes de la saponificación o la extracción del colesterol.

13. Utilización de un organismo según una de las reivindicaciones 1 a 7 para la producción de colesterol o de uno de sus intermedios metabólicos o de una mezcla de esteroles marcada con 13C o con 14C.

14. Procedimiento de producción de colesterol o de uno de sus intermedios metabólicos o de una mezcla de esteroles marcada con 13C o con 14C que comprende las etapas siguientes:

- cultivo de un organismo según una de las reivindicaciones 1 a 7 sobre un sustrato marcado con 13C o con 14C, y

- extracción de dicho colesterol, o de uno de sus intermedios metabólicos o de la mezcla de esteroles.

15. Procedimiento de fabricación de una mezcla isotópica de colesterol, de intermedios o de metabolitos de colesterol, marcados en diferentes posiciones mediante marcadores isotópicos, que comprende el cultivo de un organismo según una de las reivindicaciones 1 a 7 sobre un sustrato marcado y luego sobre un sustrato no marcado, eligiéndose la duración del cultivo sobre cada uno de estos sustratos con el fin de obtener un perfil isotópico definido.