METODO DE IDENTIFICACION DE CELULAS MADRE MESENQUIMALES SENESCENTES.

Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes. La presente invención se encuadra en el campo de la biología celular y la genética y se refiere a un método para identificar células madre mesenquimales senescentes creciendo en cultivos in vitro, que comprende: medir la longitud de los telómeros de los cromosomas, determinar el nivel de ploidía en la célula, analizar la presencia de mitosis multipolares y analizar el nivel de expresión de los genes SCIN, AKAP9, EDN-1, CXCL1, CXCL12 y/o CD70. Este método puede ser de utilidad para la realización de estudios de estabilidad genética en los cultivos de células madre mesenquimales cuyas células van a ser empleadas en terapia celular, lo que permite identificar y seleccionar aquellos más estables y apropiados para tal fin. Estado de la técnica anterior Las células madre mesenquimales humanas (hMSC) han sido propuestas en los últimos años como una poderosa herramienta en terapia celular por su elevado potencial para proliferar y diferenciarse en células derivadas del mesodermo (osteocitos, condrocitos y adipocitos), lo que permite su uso en el tratamiento de algunas patologías asociadas con inflamación crónica, envejecimiento, enfermedades autoinmunes y patologías asociadas a traumas, como por ejemplo la enfermedad del injerto contra el huésped, las fístulas relacionadas con la enfermedad de Chron, la artritis reumatoide, el infarto de miocardio o las condiciones degenerativas de cartílago y hueso. No obstante, aunque existen fuentes de MSCs disponibles en diferentes tejidos, su cantidad en el cuerpo es escasa. La mayoría de los protocolos de terapia celular utilizan entre 10-50 millones de hMSCs por tratamiento, por lo que estas células necesitan ser expandidas en cultivos in vitro durante 4 a 8 semanas antes de su implantación. Además, estos cultivos con frecuencia se llevan a cabo en presencia de condiciones pro-oxidativas (20% de O 2) y de concentraciones elevadas de suero y glucosa donde las células sufren mutaciones y anormalidades cromosómicas que ponen en peligro su bioseguridad para ser utilizadas en clínica. Estos largos períodos de cultivo y el daño oxidativo contribuyen a la senescencia celular y a la inestabilidad genética, lo que puede alterar las propiedades de las células limitando su utilidad biomédica. La senescencia está mediada principalmente por la activación de los genes supresores tumorales que detienen el ciclo celular p15/p16/Rb y p19 arf /p53/p21 (US2002123526 A1). Además, las células senescentes tienen sobreexpresados marcadores asociados a estrés como SA-ß-galactosidasa o Lipofuscina (Krzysztof Ksiazek, 2009, Rejuvenation Research, Vol. 12, No. 2: 105-116), así como programas que incrementan el nivel de citoquinas proinflamatorias. Sin embargo, es necesaria la identificación de biomarcadores de senescencia más específicos que permitan detectar el nivel de senescencia en los cultivos de células madre mesenquimales para la realización de controles de calidad antes de su aplicación biomédica. Las células senescentes poseen alteraciones en algunos parámetros de su fisiología y alteran las características de las células vecinas. La poliploidía (duplicaciones de todo el complemento cromosómico) constituye un marcador de estrés celular en la mayoría de los tejidos y se cree que es un mecanismo precursor de la aneuploidía, la cual se considera un factor fundamental asociado con el envejecimiento y con la transformación celular, ya que la mayoría de los tumores son aneuploides. Algunos autores han demostrado la presencia de aneuploidía en células madre mesenquimales procedentes de la médula ósea de primates no humanos creciendo en cultivo (Reza Izadpanah, et al., 2008, Cancer Research, Vol. 68, No. 11: 4229-4238). Por lo tanto, la aneuploidía ha sido propuesta como otra característica de las células senescentes (Steven R. Schwarze, et al., 2005, Neoplasia, Vol. 7, No. 9: 816-823). Estudios previos, han demostrado que durante el cultivo celular prolongado de las células madre embrionarias humanas se produce una predisposición para el mantenimiento y la selección de aneuploidías cromosómicas específicas para los cromosomas 12, 17, X y 20q que posiblemente proporcionan una ventaja selectiva para la propagación de las células madre embrionarias humanas que se mantienen indefinidamente en cultivo (Spits, C. et al., 2008, Nature Biotechnology, Vol. 26:1361-1363). Por otro lado, uno de los mecanismos principales de inducción de senescencia en las células es el acortamiento de los telómeros. Los telómeros son los extremos terminales de los cromosomas eucariotas y son cruciales para mantener la estabilidad genética: el mantenimiento de la longitud y la función de los telómeros es un requisito para la división celular y para una correcta segregación cromosómica. Este proceso de mantenimiento en la mayoría de las células es llevado a cabo por la telomerasa transcriptasa inversa que añade repeticiones al final de los cromosomas. La senescencia de las células madre mesenquimales se ha asociado con un acortamiento progresivo de la longitud telomérica a medida que van avanzando los pases del cultivo (Melissa A. Baxter, et al., 2004, Stem Cells, 22:675-682). Otra de las aproximaciones que se han llevado a cabo para la detección de biomarcadores de senescencia en células madre mesenquimales en cultivo pasa por el análisis de la expresión genética de todo el transcriptoma de estas células para identificar aquellos genes que se expresan de manera diferencial en las células senescentes y en las no senescentes. Los genes identificados para su uso como biomarcadores de senescencia en su mayoría se encuentran relacionados con la proliferación celular, la respuesta a estrés, el desarrollo, el ciclo celular, la mitosis, la replicación y reparación del ADN, etc. (Eunsook Ryu, et al., 2008, Biochemical and Biophysical Research Communications, 371:431-436). 2 ES 2 351 916 A1 Otros estudios basados en la identificación de biomarcadores de senescencia han analizado el impacto de la senescencia en el fenotipo, la diferenciación y los patrones de expresión génica global de MSC creciendo en cultivo. Así, se ha asociado un acortamiento de los telómeros de los cromosomas y una expresión reducida de algunos de los genes implicados en la replicación y reparación del ADN con la senescencia en estas células (Wolfgang Wagner, et al., 2008, PLoS ONE, Vol. 3, No. 5). De manera que el acortamiento de los telómeros, la aneuploidía y las alteraciones en los patrones de expresión génica respecto a las células no senescentes son características que han sido asociadas con el fenotipo senescente. No obstante, es necesario disponer de un método completo, que sea fiable y reproducible, que analice todos los parámetros implicados en el desarrollo de la senescencia, capaz de detectar células madre mesenquimales senescentes en cultivo. Este método permitiría analizar la estabilidad genética de las mismas, lo cual es de especial relevancia dadas las importantes aplicaciones que poseen estas células en el campo de la terapia celular. Descripción de la invención La presente invención proporciona un método para identificar células madre mesenquimales senescentes creciendo en cultivos in vitro, que comprende: medir la longitud media de los telómeros de los cromosomas, determinar el nivel de ploidía en la célula, analizar el número de mitosis multipolares y analizar el nivel de expresión de los genes SCIN (escinderina), EDN-1 (endotelina-1), AKAP9 (proteína de anclaje Kinasa A, yotatio), CXCL12, CXCL1 o CD70, implicados en el control de la ploidía y la poliploidización. Este método puede ser de utilidad para la realización de estudios de estabilidad genética en los cultivos de células madre mesenquimales cuyas células van a ser empleadas en terapia celular, lo que permite identificar y seleccionar aquellos más estables y apropiados para tal fin. Los inventores han llevado a cabo un análisis de la expresión genética diferencial de células madre mesenquimales en el pase 21 y en el pase 2 de un cultivo en presencia de 20% de O2 para conocer qué genes se expresan de manera diferencial en ambas poblaciones y si esta diferencia en la expresión es significativa. Tras llevar a cabo un análisis para conocer qué genes de expresión alterada están implicados en procesos de inestabilidad genética, han demostrado que existen 69 genes alterados implicados en procesos de cáncer y del ciclo celular. De todos estos genes cuya expresión se encuentra alterada en la senescencia se han seleccionado los 8 de expresión diferencial más significativa que están implicados en el mantenimiento del nivel de ploidía. En base a este análisis se ha concluido que la senescencia de las células madre mesenquimales esta relacionada con una sobreexpresión de SCIN (escinderina),... [Seguir leyendo]

1. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes que comprende: a. medir la longitud de los telómeros de los cromosomas de la célula madre mesenquimal, b. determinar el nivel de ploidía de la célula madre mesenquimal del paso (a), c. analizar la presencia de mitosis multipolar en la célula madre mesenquimal del paso (b), d. analizar el nivel de expresión de los genes SCIN, EDN-1, AKAP9, CXCL1, CXCL12 y/o CD70 en la célula madre mesenquimal del paso (c), y e. asociar los datos obtenidos en los pasos (a)-(d) con un fenotipo senescente. 2. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según la reivindicación 1 donde la medida de la longitud de los telómeros de los cromosomas del paso (a) se realiza mediante al menos uno de los siguientes métodos: FISH cuantitativo y/o TRAP. 3. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde la determinación del nivel de ploidía del paso (b) se realiza mediante la hibridación con sondas cromosómicas específicas y un posterior recuento de su señal fluorescente. 4. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según la reivindicación 3 donde las sondas cromosómicas específicas son sondas CEP. 5. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según la reivindicación 4 donde las sondas CEP son específicas de los cromosomas 8, 10, 11 y/o 17. 6. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según la reivindicación 5 donde las sondas CEP son específicas del cromosoma 10. 7. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde el fenotipo senescente del paso (e) se caracteriza por presentar: a. una reducción en la longitud de los telómeros de los cromosomas respecto a una célula no senescente, b. aneuploidía, c. mitosis multipolar, d. una expresión elevada de los genes SCIN, AKAP9 y/o EDN-1, y/o e. una expresión reducida de los genes CXCL1, CXCL12 y/o CD70. 8. Método de identificación de células madre mesenquimales senescentes según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde las células madre mesenquimales proceden de un humano. 9. Kit de identificación de células madre mesenquimales senescentes que comprende: sondas PNA, sondas CEP y sondas Taqman específicas para los genes SCIN, AKAP9, EDN-1, CXCL1, CXCL12 y CD70. 10. Kit de identificación de células madre mesenquimales senescentes según la reivindicación 9 donde las sondas CEP son específicas de los cromosomas 8, 10, 11 y/o 17. 11 ES 2 351 916 A1 12 ES 2 351 916 A1 13 ES 2 351 916 A1 14 ES 2 351 916 A1 ES 2 351 916 A1 16 ES 2 351 916 A1 17 ES 2 351 916 A1 18 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA