Método de determinación de grupos específicos que constituyen las heparinas o las heparinas de bajo peso molecular.

Método de análisis de heparinas o de heparinas de bajo peso molecular para buscar la presencia de cadenas deoligosacáridos cuya terminación está modificada por un enlace 1,

6-anhidro, caracterizado por que se efectúan lassiguientes etapas :

1) despolimerización de la muestra por acción de las heparinasas,

2) reducción del despolimerizado,

3) dosificación por cromatografía líquida de alta resolución, el método de cromatografía utilizado que es unacromatografía por intercambio de aniones para la determinación de los grupos 1,6-anhidro, en la que :

- se utiliza una fase móvil transparente en el UV hasta 200 nm y

- una doble detección a 234 nm por una parte y 202-230nm por otra parte que permite detectasselectivamente los azúcares acetilados, efectuándose dicho método tomando como señal, para la detecciónselectiva de los azúcares acetilados, la diferencia entre la absorbancia a estas 2 longitudes de onda (202 y230 nm) elegidas de tal maneta que la absortividad de los sacáridos no acetilados se anula,y caracterizada por que los residuos 1,6-anhidro obtenidos durante la reacción de despolimerización son lossiguientes :

Método de determinación de grupos específicos que constituyen las heparinas o las heparinas de bajo peso molecular

La presente invención tiene por objeto un método de análisis de grupos específicos que constituyen las heparinas o 5 las heparinas de bajo peso molecular.

Durante el procedimiento de preparación de la Enoxaparina (Lovenox®) (US 5.389.618) a partir de la heparina pura, la etapa del procedimiento de despolimerización alcalina en fase acuosa produce una transformación parcial, pero característica de las glucosaminas de las terminaciones reductoras de las cadenas oligosacarídicas.

La primera etapa de esta transformación consiste en una epimerización glucosamina<manosamina (T. Toida and al,

J. Carbohydrate Chemistr y , 15 (3) , 351-360 (1996) ) ; la segunda etapa es una 6-O desulfatación de la glucosamina que conduce a la formación de derivados denominados « 1, 6 anhidro » (solicitud de patente internacional WO01/29055) .

Este tipo de derivado solo se obtiene para las cadenas oligosacáridas cuya glucosamina terminal está 6-O sulfatada.

El porcentaje de cadenas oligosacarídicas cuya terminación está modificada por un enlace 1, 6-anhidro es una característica estructural de la mezcla de oligosacáridos de Lovenox y debe poder medirse. La presente invención consiste por lo tanto en un método de análisis de las heparinas, de las heparinas de bajo peso molecular y más particularmente de Lovenox. El método de análisis según la invención es el siguiente: 20 La muestra que se va a dosificar se despolimeriza por acción de heparinasas, después si procede el despolimerizado obtenido se reduce, después se efectúa un análisis por cromatografía líquida de alta resolución.

El método tal como se define más arriba por lo tanto se caracteriza en que se busca la presencia de cadenas oligosacáridas cuya terminación está modificada por un enlace 1, 6-anhidro (« Grupos 1, 6 anhidro ») .

En particular, la muestra que se va a dosificar en primer lugar se despolimeriza de forma exhaustiva con una mezcla de heparinasas y particularmente de heparinasa 1 (EC 4.2.2.7.) , de heparinasa 2 (heparin Liasa II) y de heparinasa 3

(EC4.2.2.8.) ) . (Estas enzimas son comercializadas por la compañía Grampian Enzymes) . La solicitud internacional W088/02400 describe un método de despolimerización de la heparina por una heparinasa y neutralización de la actividad anticoagulante de la heparina contenida en una muestra sanguínea.

La invención tiene por lo tanto por objeto un método de análisis de heparinas o de heparinas de bajo peso molecular para buscar la presencia de cadenas oligosacáridas cuya terminación está modificada por un enlace 1, 6-anhidro,

caracterizado por que se efectúan las siguientes etapas :

1) despolimerización de la muestra por acción de las heparinasas,

2) reducción del despolimerizado,

3) dosificación por cromatografía líquida de alta resolución, el método de cromatografía utilizado que es una cromatografía por intercambio de aniones para la determinación de los grupos 1, 6-anhidro, en la que :

o se utiliza una fase móvil transparente en el UV hasta 200 nm y

o una doble detección a 234 nm por una parte y 202-230nm por otra parte que permite detectas selectivamente los azúcares acetilados, efectuándose dicho método tomando como señal, para la detección selectiva de los azúcares acetilados, la diferencia entre la absorbancia a estas 2 longitudes de onda (202 y 230 nm) elegidas de tal maneta que la absortividad de los sacáridos no acetilados se anula,

y caracterizada por que los residuos 1, 6-anhidro obtenidos durante la reacción de despolimerización son los siguientes :

las heparinasas están en forma de una mezcla de heparinasa 1 (EC 4.2.2.7.) , de heparinasa 2 (heparin liasa II) y de heparinasa 3 (EC.4.2.2.8.)

El despolimerizado así preparado se trata a continuación de preferencia con una disolución de NaBH4 en acetato de sodio. Esta última operación permite reducir específicamente las extremidades reductoras que no están en la forma 1, 6 anhidro (productos descritos en la solicitud de patente internacional WO 01/72762) . Por último, para poder cuantificar los disacáridos 1 y 2 descritos más arriba, la muestra de heparina de bajo peso molecular, despolimerizada por las heparinasas, debe reducirse por la acción de un agente reductor tal como NaBH4.

La invención tiene por tanto más particularmente por objeto el método tal como se define más arriba, caracterizado por que la heparina despolimerizada se reduce a continuación.

La invención tiene más particularmente por objeto el método tal como se define anteriormente caracterizado por que el agente de reducción es NaBH4. Se podrá opcionalmente utilizar otra sal de metal alcalino de borohidruro tal como litio o potasio.

La dosificación de las terminaciones 1, 6 anhidro se realiza a continuación por HPLC (Cromatografía Líquida de Alta resolución) y en particular por cromatografía de intercambio de aniones.

El método de dosificación según la invención permite diferenciar bien el Lovenox de las otras heparinas de bajo peso molecular que no contienen estos derivados « 1, 6-anhidro ». A la inversa, el método de dosificación según la invención permite asegurarse de que las heparinas de bajo peso molecular no reúnen las características físicoquímicas del Lovenox y por lo tanto son de naturaleza diferente.

El método de dosificación según la invención puede aplicarse al procedimiento industrial en los controles de muestras durante el procedimiento, para asegurar una estandarización del procedimiento de fabricación del Lovenox y obtener lotes uniformes.

Después de la despolimerización enzimática y reducción de las extremidades reductora, se encuentran los derivados 1, 6-anhidro del Lovenox en 4 formas esenciales.

Todos los oligosacáridos o polisacáridos que comprenden el extremo 1, 6-anhidro sobre la unidad disacarídica terminal y que no poseen un 2-0 sulfato sobre el ácido urónico de dicho disacárido terminal, son totalmente despolimerizados por las heparinasas y en la forma de los disacáridos 1 y 2. Por el contrario, cuando dicho sacárido terminal comprende un 2-0 sulfato sobre el ácido urónico y está en la forma manosamina, el derivado 1, 6 anhidro se encuentra en la forma de tetrasacárido 1 (forma resistente a las heparinasas) .

El trisacárido 1 (véase más abajo) , está igualmente presente en la mezcla. Procede de otro proceso de degradación que conduce a la estructura a continuación (fenómeno de separación observado en la despolimerización química del Lovenox.

trisacárido 1

Los otros constituyentes de la mezcla no son característicos únicamente del Lovenox. Existen por supuesto los 8 disacáridos elementales de la cadena heparínica. Estos 8 disacáridos elementales son comercializados entre otros por la compañía Sigma.

Se han identificado en la mezcla otros disacáridos por el método según la invención: los disacáridos LIIsgal y LIVsgal que tiene como origen la 2-0 desulfatación alcalina de -IdoA (2S) -GlcNS (6S) - y de -IdoA (2S) -GlcNS-que conduce a la formación de 2 ácidos galacturónicos. No están presentes habitualmente en la estructura original de la heparina (U.M. Desai et Coll. Arch. Biochem. Biophys., 306 (2) 461-468 (1993) .

Los oligosacáridos que comprenden glucosaminas 3-0 sulfatadas resisten a la escisión por las heparinasas y permanecen presenten en forma de tetrasacáridos.

En el caso de la mayoría de las heparinas de bajo peso molecular, la heparina se extrae de la mucosidad porcina, y estos tetrasacáridos principales están representados más abajo. Son resistentes a la despolimerización enzimática y son el reflejo de las secuencias afines a la antitrombina III. Se simbolizan así : LIIa-IIsglu y LIIa-IVsglu. (S.YAMADA, K.YOSHIDA, M. SUGIURA, K.SUGAHARA, K-H KHOO, H.R. MORRIS, A. DELL, J.Biol.Chem. ; 270 (7) , 4780-4787 (1993)

El último constituyentes de la mezcla escindida por las heparinasas es la terminación glicoserina LGlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser (K.SUGAHARA, H.TSUDA, K.YOSHIDA, S.YAMADA, J.Biol.Chem. ; 270 (39) , 22914-22923 (1995) ; K.SUGAHARA, S.YAMADA, K.YOSHIDA, P. de WAARD, J.F.G. VLIEGENTHART ; J.Biol.Chem. ; 267 (3) , 1528-1533 (1992) . Esté último está generalmente casi ausente del Lovenox (Véase RMN en el ejemplo 5) .

Otro aspecto de la invención se sitúa a nivel del procedimiento de cromatografía utilizado para la determinación de los grupos 1, 6-anhidro. En principio se trata de separar los diferentes polisacáridos obtenidos después de la despolimerización y tratamiento con un... [Seguir leyendo]

1. Método de análisis de heparinas o de heparinas de bajo peso molecular para buscar la presencia de cadenas de oligosacáridos cuya terminación está modificada por un enlace 1, 6-anhidro, caracterizado por que se efectúan las siguientes etapas :

1) despolimerización de la muestra por acción de las heparinasas,

2) reducción del despolimerizado,

3) dosificación por cromatografía líquida de alta resolución, el método de cromatografía utilizado que es una cromatografía por intercambio de aniones para la determinación de los grupos 1, 6-anhidro, en la que :

- se utiliza una fase móvil transparente en el UV hasta 200 nm y

- una doble detección a 234 nm por una parte .

20. 230nm por otra parte que permite detectas selectivamente los azúcares acetilados, efectuándose dicho método tomando como señal, para la detección selectiva de los azúcares acetilados, la diferencia entre la absorbancia a estas 2 longitudes de onda (202 y 230 nm) elegidas de tal maneta que la absortividad de los sacáridos no acetilados se anula,

y caracterizada por que los residuos 1, 6-anhidro obtenidos durante la reacción de despolimerización son los 15 siguientes :

2. Método tal como se define en la reivindicación 1 caracterizado por que las heparinasas son en forma de una mezcla de heparinasa 1 (EC 4.2.2.7.) , de heparinasa 2 (heparina liasa II) y de heparinasa 3 (EC.4.2.2.8.)

3. Método tal como se define en la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la heparina despolimerizada por acción de heparinasa (despolimerizado) se somete a continuación a un agente de reducción.

4. Método tal como se define en la reivindicación 3, caracterizado por que el agente de reducción es el NaBH4 o una 25 sal de metal alcalino del anión borohidruro.

5. Método tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la fase móvil utilizada es a base de perclorato de sodio, de sales de metano sulfonato o de sales de fosfato.

6. Método tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que las 2 longitudes de onda para la detección de los azúcares acetilados son de 202 y 230 nm.

7. Derivado 1, 6 anhidro de fórmula (disacárido 1) :

8. Derivado , 1, 6 anhidro de fórmula (disacárido 2) :

9. Derivado , 1, 6 anhidro de fórmula (disacárido 3) :

10. Derivado trisacárido de fórmula :

Figura 1

Figura 2