PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE LOCUS DEL ANTIGENO CLASE II DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODOS Y MATERIALES PARA DETERMINAR EL HLA DE CLASE II DE UN SUJETO,

EN LOS QUE SE EMPLEAN SECUENCIAS ESPECIFICAS DE GRUPO PARA DISEÑAR MOLECULAS CEBADORAS, LAS CUALES SE PUEDEN EMPLEAR EN PROTOCOLOS DE AMPLIFICACION QUE IDENTIFICAN DE FORMA PRECISA EL GRUPO O GRUPOS Y/O EL ALELO O ALELOS QUE LLEVA UN SUJETO

La presente invención se refiere a procedimientos y materiales para determinar el tipo de HLA clase II de un sujeto, en los que se utilizan secuencias específicas para el grupo para diseñar las moléculas iniciadoras que pueden usarse en protocolos de amplificación que identifiquen exactamente el o los grupos de HLA y / o los alelos portados por el sujeto.

El complejo de antígeno leucocitario humano (HLA) clase II comprende los genes que codifican HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. El complejo comprende varios loci genéticos entre los que se mencionan especialmente: DRB1, DRB2, DRB3, DRB4, DRB5, DRB6, DRB7, DRB8, DRB9, DQA1, DQA2, DQB1, DQB2, DPA1, DPA2, DPB1, DPB2.

Los genes del HLA clase II son altamente polimórficos entre individuos. Esta variabilidad es de una particular relevancia cuando se contempla un transplante órganos o tejidos entre un donante y un receptor. Los antígenos de histocompatibilidad del donante y del receptor deben ser tan similares como sea posible para evitar tanto el rechazo inmune del tejido transplantado como el síndrome del injerto contra el receptor. Por lo tanto es importante identificar exactamente los tipos de HLA del donante y del receptor. A la vista de las exigencias implícitas en el transplante de tejidos, es deseable que la tipificación se realice tan exactamente como sea posible.

Se ha investigado mucho sobre los procedimientos para determinar los alelos del HLA en una muestra de un paciente a causa de la importancia funcional de estos genes en la compatibilidad de los tejidos y en las enfermedades autoinmunes en transplantes. Las primeras pruebas desarrolladas usaban procedimientos inmunológicos para identificar epítopos expresados por diferentes loci del HLA. Estas pruebas (por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento, descrito por Terasaki y Mc Clelland, Nature, 204: 998 (1964)) identificaban amplias especificidades serológicas pero no eran capaces de diferenciar los miembros alélicos de un grupo y a veces identificaban grupos de forma completamente incorrecta. Desafortunadamente, incluso el más exacto de dichos ensayos de baja resolución no puede detectar y diferenciar todos los antígenos de transplante funcionalmente significativos (Anasetti y colaboradores, Hum. Immunol., 29: 70 (1990)).

Las pruebas de alta resolución realizadas al nivel del ácido nucleico que diferencian los alelos de cada grupo han sido el foco de recientes investigaciones. Los procedimientos actuales de tipificación de alta resolución incluyen los siguientes.

La técnica de las sondas de oligonucleótidos específicas para la secuencia (SSOP), tal como se describe en la patente de EE.UU. núm. 5.451.512 cuya titularidad ostenta Hoffmann -La Roche, Inc., utiliza un formato de transferencia en mancha inversa, en el que se inmovilizan sondas de HLA-A sobre una membrana y el ADN diana etiquetado (muestra del paciente) se hibrida con la sonda unida a la membrana (tal como es descrito por Saiki y colaboradores, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 6230 -6234). El modelo de hibridación para las sondas sobre transferencia en mancha da información relativa al tipo de HLA del individuo. Sin embargo, ya que la hibridación inherentemente no es suficientemente específica para descartar diferencias menores en la secuencia entre la sonda y la muestra del paciente, existe la posibilidad de que la muestra del paciente pueda contener una variante alélica que no se tenga en cuenta.

Otro ensayo basado en el ácido nucleico es el sistema de mutación refractaria por amplificación (ARMS) tal como se describe en el manual de referencia del “HLA Class I SSP ARMS -PCR Typing Kit”, edición de junio de 1995, publicado por la Imperial Cancer Research Fund. Este ensayo se basa en la necesidad de complementariedad (emparejamiento) entre el terminal 3' de un iniciador de amplificación y una secuencia de ADN diana. En ausencia de tal emparejamiento, el iniciador no funcionará adecuadamente y no se amplificará ningún fragmento. La información de la secuencia se deduce determinando, para diferentes pares de iniciadores que actúan sobre un ADN diana de una muestra de un paciente, si el fragmente está o no amplificado con éxito. La exactitud de la técnica está limitada por el número de pares de iniciadores comprobados y por la posibilidad de que existan variaciones alélicas en regiones de ADN que descansen entre los iniciadores.

Para vencer los anteriores inconvenientes, se ha propuesto que la tipificación sea realizada mediante secuenciación directa de ADN (Santamaria y colaboradores, “HLA Class II typing: direct sequencing of DRB, DQB, and DQA genes”, Hum. Immunol. 33, 69 -81 (1992); Santamaria y colaboradores, “HLA Class I Sequence-Based Typing”, Hum. Immunol. 37, 39 50 (1993); WO9219771; Pat. de EE.UU. 5.424.184). Sin embargo, mientras la secuenciación directa del locus del HLA Clase II del paciente puede ser conceptualmente más exacta, dicha secuenciación puede requerir un plazo inadecuado para la práctica clínica. Puede esperarse que el éxito de los procedimientos de secuenciación directa esté basado en el diseño de protocolos eficaces y las secuencias iniciadoras pertinentes.

Antes de la presente invención, los protocolos de secuenciación directa habían presentado un número de desventajas. Por ejemplo, el procedimiento de Santamaria y colaboradores, supra, falla en el suministro de información suficiente ya que se centra en secuencias de ADNc (exón) que, en vista de la diversidad de secuencias del exón, ofrecen una selección muy limitada de sitios conservados de hibridación de iniciadores. Además, a causa de que los iniciadores de secuenciación de Santamiaria hibridan dentro de un exón, no suministran la información sobre la secuencia de ADN por encima del iniciador que potencialmente es decisiva para diferenciar los alelos. Por otra parte, los sitios presentados se determinaron antes del reciente descubrimiento de docenas de más alelos que no es necesario que sean considerados en la identificación del tipo de HLA.

Secuencias de intrones podrían proporcionar los sitios de hibridación preferidos para la amplificación y secuenciación de iniciadores para genes de HLA clase II ya que pueden suministrar la secuencia de ADN para el exón completo.

La existencia de intrones, que interrumpen la regiones codificantes de genes nucleares, es una característica típica del ADN genómico en eucariotas complejos. Los intrones son habitualmente mucho más largos que los exones y son responsables de la mayor parte de los genes estructurales. En la presente invención, especialmente las secuencias del intrón 1 y del intrón 2 que se sitúan en el terminal 5' y en el terminal 3', respectivamente, del exón 2 son especialmente importantes.

Un número de investigadores han echo un uso limitado de los oligonucleótidos basados en intrones para aspectos limitados de la tipificación del HLA Clase I.

La solicitud de patente europea EP-A-90.309107.2 de GENETIPO AG descubre un procedimiento de análisis de secuencias de intrones para la detección de alelos de locus adyacentes y remotos como haplotipos. De acuerdo con este procedimiento, el ADN genómico se amplifica con un par de iniciadores que abarca una secuencia de una región no codificante (intrón). El par de iniciadores utilizado define una secuencia de ADN que está en enlace genético con un alelo a ser detectado.

Blasczyk y colaboradores (Tissue Antigens 1996: 47: 102 -110) usaron iniciadores de amplificación basados en exones para determinar la especificidad de grupo del HLA clase I. Después de la amplificación, se usaron iniciadores de secuenciación universales situados en el intrón 2 para secuenciar el fragmento amplificado. El documento no descubre ningún motivo de secuencia de intrón del intrón 1 ó 3 o de la región 5' no traducida. Cereb y colaboradores (Tissue Antigens 1995: 45: 1 -11) acometieron la identificación de las secuencias de intrones útiles para conjuntos de iniciadores de amplificación específicos para el locus para todos los genes Clase I. Estos conjuntos de iniciadores se diseñaron para amplificar todos los alelos del mismo locus. No se observaron ni se informó de iniciadores de amplificación específicos para grupos. Además, los fragmentos amplificados fueron caracterizados mediante SSOP y no mediante secuenciación directa.

Li W. -H y colaboradores [Fundamentals of molecular evolution, Sunderland, MA; Sinauer Associates (1991)] han especulado, basándose en la información obtenida de otros genes, que intrones del HLA Clase II podrían tener incluso más variación...

1. Un procedimiento para determinar el tipo de grupo del HLA Clase II que es parte del locus HLA -DRB1, HLA – DRB3, HLA – DRB4 o HLA – DRB5 de un sujeto que comprende los siguientes pasos:

i) combinar un par de iniciadores específicos para el grupo con una muestra de ADN diana de un sujeto bajo condiciones tales que pueda producirse la amplificación basada en los iniciadores del ADN diana; y

ii) determinar de si se produce un producto de ácido nucleico mediante la amplificación,

en el que la capacidad del par de iniciadores para producir un producto de ácido nucleico se asocia con un tipo de grupo de HLA en particular, que se caracteriza porque el iniciador sentido se sitúa dentro del intrón 1 y el iniciador antisentido se sitúa dentro del intrón 2.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además el comprende el paso de

iii) determinar la secuencia de ácido nucleico del producto de ácido nucleico del paso (ii)

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el par de iniciadores comprende uno o más iniciadores de oligonucleótidos seleccionados entre el grupo que consta de los Núm Id Seq: 2 – 16, 18 – 23 y70 – 95.

4. Un procedimiento para determinar el tipo de grupo del HLA Clase II que es parte del locus HLA -DRB1, HLA – DRB3, HLA – DRB4 o HLA – DRB5 o del tipo de alelo de un sujeto que comprende los siguientes pasos:

i) combinar un par de iniciadores de la región intrónica específicos para el grupo con una muestra de ADN diana de un sujeto bajo condiciones tales que pueda producirse esa amplificación basada en los iniciadores del ADN diana, en donde el iniciador sentido se sitúa en el intrón 1 y el iniciador antisentido se sitúa dentro del intrón 2;

ii) hibridar el producto de amplificación con al menos una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia;

iii) obtener una secuencia parcial del producto de la amplificación determinando 5 qué oligonucleótido específico para la secuencia se ha hibridado;

iv) identificar de una lista de secuencias conocidas de HLA Clase II, el grupo o el alelo que contiene la secuencia parcial obtenida en (iii);

5. Un procedimiento para determinar el grupo del HLA Clase II que es parte del locus HLA -DRB1, HLA – DRB3, HLA – DRB4 o HLA – DRB5 o un tipo de alelo de un sujeto que comprende los siguientes pasos:

i) combinar el par de iniciadores de la región intrónica específicos para loci con una muestra de ADN diana del sujeto bajo condiciones tales que pueda ocurrir la amplificación basada en los iniciadores del ADN diana, en el que el iniciador sentido se sitúa en el intrón 1 y el iniciador antisentido se sitúa en el intrón 2;

ii) hibridar el producto de la amplificación con al menos una sonda de 20 oligonucleótidos específica para el grupo.