NUEVOS OLIGOSACÁRIDOS, SU PREPARACIÓN Y LAS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE LOS CONTIENEN.

Oligosacáridos de fórmula : **Fórmula**

en la que n es un número entero de 0 a 25,

R1, R3, R4 y R5, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M, R2 y R6, idénticos o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o un radical SO3M o COCH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio

sus mezclas, sus diaestereois6meros, su procedimiento de preparación y las composiciones farmaceuticas que los contienen.

Han sido descritos disacaridos sulfatados que poseen en la extremidad reductora una estructura 1, 6-anhidro por H.P. WESSEL, J. Carbohydrate Chemistr y , 11 (8) , 1039-1052 (1992) ;no se menciona para estos ninguna actividad farmacológica.

Han sido descritos igualmente trisacaridos sulfatados que comprenden un resto 1, 6-anhidro en la patente EP84999 y por Y. ICHIKAWA et coll., Carbohydr. Res, 141, 273-282 (1985) como intermedios para la preparación de oligosacaridos superiores. Estos trisacaridos tienen una actividad anti-Xa debil.

En la fórmula (I) n es un numero entero de 0 a 25, R1, R3, R4 y R5, identicos o diferentes, representan un atomo de hidr6geno o un radical S03M, R2 y R6, identicos o diferentes, representan un atomo de hidr6geno o un radical S03M 15 o C0CH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio.

Estos oligosacaridos comprenden as! un numero par de sacaridos.

En la fórmula (I) , R4 es, de preferencia, un atomo de hidr6geno.

De forma preferencial, n es un numero entero de 0 a 10 y, en particular, de 0 a 6 e incluso mas particularmente de 1 a 6.

Los oligosacaridos de fórmula (I) pueden prepararse por acción de un hidr6xido de metal alcalino o de amonio cuaternario sobre los oligosacaridos de fórmula :

en la que n es un numero entero de 0 a 25, R1, R3, R4 y R5, identicos o diferentes, representan un atomo de hidr6geno o un radical S03M, R2 y R6, identicos o diferentes, representan un atomo de hidr6geno o un radical S03M 25 o C0CH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio o una mezcla de estos. Esta reacción se efectua en medio acuoso, a una temperatura de 40 a 80º C, a un pH de 10 a 13. Como hidr6xido de metal alcalino que se puede utilizar, se puede citar la sosa, la potasa, el hidr6xido de litio y el hidr6xido de cesio. Como hidr6xido de amonio cuaternario que se puede utilizar, se puede citar el hidr6xido de tetrabutilamonio.

La cantidad de hidr6xido de metal alcalino o de amonio cuaternario debe ser suficiente para que el pH del medio de reacción permanezca estable durante toda la duración de la reacción. As! es necesario anadir en continuo a lo largo de la reacción el hidr6xido de metal alcalino o amonio cuaternario.

De preferencia, el hidr6xido de metal alcalino o de amonio cuaternario esta en forma de disolución acuosa de 1 a 5%.

De forma preferente, la reacción se efectua a una temperatura de 60 a 70º C.

Ventajosamente, el pH de reacción es de 11 a 12, 5.

La reacción se para por acidificación del medio de reacción, por ejemplo por adición de resina acido tal como la resina Amberlite IR120R (Fluka) .

Los oligosacaridos de fórmula (I) se pueden purificar opcionalmente por cromatograf!a por permeación de gel de tipo poliacrilamida-agarosa tal como el comercializado con la marca Ultrogel ACA202R (Biosepra) segun el protocolo descrito a continuación para la separación de los oligosacaridos intermedios de fórmula (II) . Los oligosacaridos de fórmula (I) para los que n es 0 o 1 pueden tambien opcionalmente purificarse sobre columna de alumina como una mezcla agua-etanol como eluyente.

Los oligosacaridos intermedios de fórmula (II) y sus mezclas se pueden obtener por separación por cromatograf!a sobre gel de una mezcla de oligosacaridos (III) obtenida por despolimerización enzimatica de la heparina o despolimerización basica del ester benc!lico de la heparina o de un ester benc!lico de heparina de semis!ntesis.

Esta cromatograf!a se efectua sobre columnas rellenas de gel de tipo poliacrilamida-agarosa tal como el comercializado con la marca Ultrogel ACA202R (Biosepra) . De preferencia, se utiliza una bater!a de columnas de gel poliacrilamida agarosa. El numero de columnas utilizadas se adapta en función del volumen, del gel y de los oligosacaridos que se van a separar. La mezcla se eluye con una disolución que contiene un tamp6n fosfato y cloruro de sodio. De preferencia, la disolución tamp6n fosfato es una disolución de 0, 02 mol/l de NaH2P04/Na2HP04 (pH 7) que contiene 0, 1 mol/l de cloruro de sodio. La detección de las diferentes fracciones se realiza por espectrometr!a UV (254 nm) e iónica (IBF) . Las fracciones as! obtenidas se pueden purificar opcionalmente por cromatograf!a SAX (intercambio aniónico fuerte, del ingles strong anion exchange) segun los metodos conocidos por el experto en la materia y particularmente segun los metodos descritos por K.G. Rice et R.J Linhardt, Carbohydrate Research 190, 219-233 (1989) , A. Larnkjaer, S.H. Hansen et P.B. 0stergaard, Carbohydrate Research, 266, 37-52 (1995) y en la patente W090/01501 (ejemplo 2) . A continuación se liofilizan las fracciones y despues se desalan en una columna rellena de gal tal como una columna de Sephadex G10R ( Pharmacia Biochemicals) .

Cuando la purificación no se realiza por cromatograf!a SAX, los liofilizados pueden purificarse opcionalmente por precipitación simple o fraccionada segun los metodos conocidos por el experto en la materia y particularmente segun el metodo descrito en la patente FR2548672. De forma general, se opera segun el siguiente protocolo :

La fracción liofilizada que se va a purificar se disuelve a 25º C en alrededor de diez volumenes de agua destilada. Por adición de metanol o etanol, se hace precipitar el oligosacarido deseado controlando su enriquecimiento por cromatograf!a HPLC (Cromatograf!a L!quida de Alto Rendimiento) . La adición de metanol o de etanol se determina en función de la pureza y del rendimiento deseado de dicho oligosacarido. Igualmente, esta operación se puede realizar en varias etapas sucesivas a partir de la disolución inicial de liofilizado. Para ello, se anade el agente insolubilizante (metanol o etanol) en pequenas porciones y se a!sla despues de cada adición el precipitado obtenido. Los precipitados as! obtenidos preparados se analizan por cromatograf!a HPLC. Segun la pureza y el rendimiento deseado, se reunen las fracciones adecuadas de precipitado.

Para los intermedios de fórmula (II) para los que n = 0, 1 o 2, es preferible partir de una mezcla (III) obtenida por despolimerización enzimatica.

Esta despolimerización se efectua por medio de heparinasa I (EC 4.2.2.7) , en el seno de una disolución tamp6n fosfato de pH 7, en presencia de cloruro de sodio y de BSA (Albumina de Suero Bovino) , a una temperatura comprendida entre 10 y 18º C y, de preferencia 15º C, durante 8 a 10 d!as y, de preferencia, 9 d!as. La despolimerización se detiene por ejemplo por calentamiento del medio de reacción a 100º C durante 2 minutos y la mezcla se recupera por liofilización. Es preferible utilizar 7UI de heparinasa I por 25 g de heparina. La disolución tamp6n fosfato comprende generalmente 0, 05 mol/l de NaH2P04

/Na2HP04 (pH 7) en presencia de 0, 1 mol/l de cloruro de sodio. La concentración de BSA es generalmente de 2%.

Para los intermedios de fórmula (II) para los que n = 0, 1, 2, 3 o 4, es preferible partir de una mezcla (III) obtenida por despolimerización de un ester benc!lico de la heparina.

El ester benc!lico de la heparina se puede preparar segun los metodos descritos en las patentes US5389618, EP40144, FR2548672. El nivel de esterificación estara comprendido de preferencia entre 50 y 100 %. De forma preferente, estara comprendido entre 70 y 90%.

La despolimerización se efectua en medio acuoso, por medio de un hidr6xido de metal alcalino (hidr6xido de litio, sosa, potasa o hidr6xido de cesio, por ejemplo) o de un hidr6xido de amonio cuaternario (hidr6xido de tetrabutilamonio, por ejemplo) , de preferencia, a una molaridad comprendida entre 0, 1 y 0, 2 mol/l, a una temperatura comprendida entre 40 y 80º C, durante 5 a 120 minutos. En un modo preferido, se opera durante 5 a 15 minutos, a una temperatura comprendida entre 60 y 70º C, con una disolución de hidr6xido de sodio de 0, 15 mol/l. La reacción de despolimerización se detiene por neutralización por adición de un acido tal como el acido acetico. Despues de la adición de 10% en peso por volumen de acetato de sodio, la mezcla de oligosacaridos se precipita por adición de metanol, de preferencia 2 volumenes por 1 volumen de medio de reacción y se filtra.

Segun un aspecto preferido de la invención, la mezcla de oligosacaridos obtenida despues de la despolimerización qu!mica, en forma de una disolución... [Seguir leyendo]

1. 0ligosacaridos de fórmula :

en la que n es un numero entero de 0 a 25, R1, R3, R4 y R5, identicos o diferentes, representan un atomo de 5 hidr6geno o un radical S03M, R2 y R6, identicos o diferentes, representan un atomo de hidr6geno o un radical S03M

o C0CH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio.

2. 0ligosacaridos de fórmula (I) segun la reivindicación 1 para los que R4 representa un atomo de hidr6geno.

3. 0ligosacaridos de fórmula (I) segun una de las reivindicaciones 1 o 2 para los que n es 0 o un numero entero de 1 a 10.

10 4. 0ligosacaridos de fórmula (I) segun una de las reivindicaciones 1 o 2 para los que n es 0 o un numero entero de 1 a 6.

5. 0ligosacaridos de fórmula (I) segun una de las reivindicaciones 1 o 2 para los que n es un numero entero de 1 a

6.

6. 0ligosacaridos de fórmula (I) segun la reivindicación 1 en la que n es igual a 0.

15 7. 0ligosacaridos de fórmula (I) segun la reivindicación 1 en la que n es igual a 1.

8. 0ligosacaridos de fórmula (I) segun la reivindicación 1 en la que :

- n es igual a 0, R1 y R6 representan un radical S03Na y M es sodio y la mezcla de sus diastereois6meros

- n es igual a 1, R1, R2, R3, R5, R6, representan un radical S03Na, R4 representa un atomo de hidr6geno y M es sodio y la mezcla de sus diastereois6meros

-n es igual a 2, R1, R2, R3, R5, R6, representan un radical S03Na, R4 representa un atomo de hidr6geno y M es sodio y la mezcla de sus diastereois6meros

- n es igual a 2, R1, R2, R3, R6, representan un radical S03Na, R5 representa un atomo de hidr6geno o un radical S03Na, R4 representa un atomo de hidr6geno y M es sodio y la mezcla de sus diaesterois6meros (derivado 1, 6 anhidro LIs-Is-IIs) .

9. 0ligosacaridos de fórmula (I) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, opcionalmente purificados por cromatograf!a por permeación de gel de tipo poliacrilamida-agarosa.

1O. Una composición farmaceutica que comprende un oligosacarido de fórmula :

o sus diaestereois6meros, en la que n es 0 o un numero entero de 1 a 25, R1, R3, R4 y R5, identicos o diferentes, representan un atomo de hidr6geno o un radical S03M, R2 y R6, identicos o diferentes, representan un atomo de hidr6geno o un radical S03M o C0CH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio o una mezcla de estos.

11. Una composición farmaceutica que comprende un oligosacarido de fórmula (I) o sus diastereois6meros segun la reivindicación 10 en la que R4 representa un atomo de hidr6geno.

12. Una composición farmaceutica que comprende un oligosacarido de fórmula (I) o sus diastereois6meros segun la reivindicación 10 en la que n es 0 o un numero entero de 1 a 10.

13. Una composición farmaceutica que comprende un oligosacarido de fórmula (I) o sus diastereois6meros segun la reivindicación 10 en la que n es igual a 0 o un numero entero de 1 a 6.

14. Una composición farmaceutica que comprende un oligosacarido de fórmula (I) o sus diastereois6meros segun la reivindicación 10 en la que n es un numero entero de 1 a 6.

15. Una composición farmaceutica que comprende un oligosacarido de fórmula (I) o sus diastereois6meros segun la reivindicación 10 en la que n es igual a 0.

16. Una composición farmaceutica que comprende un oligosacarido de fórmula (I) o sus diastereois6meros segun la reivindicación 10 en la que n es igual a 1.

17. Procedimiento de preparación de oligosacaridos de fórmula (I)

o sus mezclas, en la que n es 0 o un numero entero de 1 a 25, R1, R3, R4 y R5, identicos o diferentes representan un atomo de hidr6geno o un radical S03M, R2 y R6, identicos o diferentes representan un atomo de hidr6geno o un radical S03M o C0CH3 y M es sodio, calcio, magnesio o potasio, caracterizado por que se hace reaccionar un hidr6xido de metal alcalino o de amonio cuaternario sobre los oligosacaridos de fórmula :

o una mezcla de estos en la que n, R1, R2, R3, R4, R5, R6 y M don tal como se definen anteriormente.

18. Procedimiento segun la reivindicación 17, caracterizado por que se efectua la reacción en medio acuoso, a una temperatura de 40 a 80º C y a un pH de 10 a 13.

19. Procedimiento segun la reivindicación 17 caracterizado por que se utiliza una disolución acuosa de 1 a 5% de hidr6xido de metal alcalino o de amonio cuaternario.

2O. Procedimiento segun la reivindicación 17 caracterizado por que la reacción se efectua a una temperatura de 60 a 70º C.

21. Procedimiento segun la reivindicación 17 caracterizado por que el pH de reacción es de 11 a 12, 5.

22. Procedimiento segun la reivindicación 17 caracterizado por que el hidr6xido de metal alcalino o de amonio cuaternario es sosa, potasa, hidr6xido de litio, de cesio o hidr6xido de tetrabutilamonio.

23. Procedimiento segun la reivindicación 17 en el que se a!slan los oligosacaridos de fórmula (I) segun la reivindicación 1 o sus mezclas.

24. 0ligosacaridos de fórmula (I) segun una de las reivindicaciones 1 a 9 para utilización para la prevención o el tratamiento de enfermedades asociadas a un proceso inflamatorio que implica la producción de 6xido nitrito (N0) , elegidas entre las isquemias cerebrales, cardiacas o vasculares perifericas, las osteoartritis, los traumatismos del sistema nervioso central, los traumatismos craneales, espinales y craneo-espinales, la esclerosis multiple, los

dolores neuropaticos y las neuropat!as perifericas, las enfermedades de la neurona motora, la esclerosis lateral amiotr6fica, el neurosida, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la Corea de Huntington.

25. Composiciones segun la reivindicación 10 a para utilización para la prevención o el tratamiento de enfermedades asociadas a un proceso inflamatorio que implica la producción de 6xido nitrito (N0) , elegidas entre las isquemias cerebrales, cardiacas o vasculares perifericas, las osteoartritis, los traumatismos del sistema nervioso central, los traumatismos craneales, espinales y craneo-espinales, la esclerosis multiple, los dolores neuropaticos y las neuropat!as perifericas, las enfermedades de la neurona motora, la esclerosis lateral amiotr6fica, el neurosida, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la Corea de Huntington.