MÉTODO DE PREPARACIÓN DE ADN PLASMÍDICO DE GRADO FARMACÉUTICO.

Un dispositivo de lisis celular alcalina continua que comprende:

- un primer mezclador o inyector capaz de inyectar una disolución de lisado en la dirección opuesta de una suspensión celular;

- un primer tubo de pequeno diametro para generar un flujo turbulento dentro de la mezcla;

- un segundo tubo de gran diametro para generar un flujo laminar dentro de la mezcla;

- un segundo mezclador o inyector para inyectar la disolución neutralizante en un extremo y recoger en el otro extremo la mezcla.

Metodo de preparación de ADN plasmidico de grado farmaceutico CAMPO DE LA INVENCION

Esta invención se refiere a la preparación de ADN plasmidico altamente purificado, y en particular a la producción y 5 aislamiento de ADN plasmidico de grado farmaceutico para uso en terapia basada en plasmido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los avances en la biologia molecular sugieren claramente que la terapia basada en plasmido, en particular en los campos de vacunas y terapia genica humana, pueden ser una forma eficaz para tratar enfermedades. Un obstaculo significativo de esta tecnologia, sin embargo, es encontrar formas eficientes para administrar el gen de interes a la 10 celula. Un metodo prometedor para administrar de manera segura y eficaz un gen normal a celulas humanas es mediante ADN plasmidico. El ADN plasmidico es una forma cerrada, circular de ADN bacteriano en el que puede insertarse una secuencia de ADN de interes. Una vez administrado a la celula humana, el ADNp empieza a replicarse y a producir copias de la secuencia de ADN insertada. Asi, los investigadores consideran el ADN plasmidico como un vehiculo prometedor para administrar genes normales a celulas humanas con el fin de tratar una variedad de estados patológicos.

Se necesitan cantidades enormes de ADN plasmidico para el desarrollo de la investigación para implementar esta nueva tecnologia y la terapia humana. Debido a que el ADN plasmidico utilizado en terapia genica y en otras aplicaciones clinicas es habitualmente producido por bacterias tales como Escherichia coli (E. coli) , se necesitan metodos para separar de manera eficaz el ADN plasmidico del ADN genómico (ADNg) de la celula bacteriana, asi como de endotoxinas y proteinas de la celula bacteriana. Por lo tanto, existe una necesidad creciente de procedimientos de purificación sencillos, robustos y escalables que puedan utilizarse para aislar grandes cantidades de ADN plasmidico a partir de celulas bacterianas.

Una etapa importante en cualquier procedimiento de purificación de plasmidos implica la lisis de las celulas bacterianas con el fin de liberar el contenido celular a partir del cual puede entonces aislarse el ADNp. De hecho, en 25 primer lugar es necesario conseguir tres etapas de suspensión celular, lisis celular y neutralización y precipitación de los contaminantes del anfitrión. La resuspensión celular utiliza normalmente agitación manual o agitación magnetica y un homogeneizador o mezclador impelente para resuspender las celulas en el tampón de resuspensión. La lisis celular puede realizarse mediante agitación manual o agitación magnetica con el fin de mezclar las celulas resuspendidas con la disolución de lisis (que consiste en alcali diluido (base) y detergentes) ; despues mantener la 30 mezcla a temperatura ambiente (20-25 grados Celsius) o en hielo durante un periodo de tiempo, tal como 5 minutos, para completar la lisis. Como se ha indicado anteriormente, ni la agitación manual ni la agitación magnetica son escalables. La tercera etapa es la neutralización y precipitación de los contaminantes del anfitrión. El lisado de la segunda etapa se mezcla normalmente con una disolución de neutralización fria mediante agitación suave o agitación magnetica para acidificar el lisado antes de ponerlo en hielo durante 10-30 minutos para facilitar la desnaturalización y precipitación del ADN cromos6mico de alto peso molecular, proteinas del anfitrión y otras moleculas del anfitrión. Ni la agitación manual ni la agitación magnetica son escalables.

Generalmente, la pared celular se digiere mediante tratamiento con lisozima durante poco tiempo o mediante tratamiento con acetato alcalino o de potasio (KOAc) . Generalmente, tambien se anade ARNasa para degradar los ARN de la suspensión bacteriana. Estas etapas quimicas pueden resultar eficaces para lisar las celulas a pequena 40 escala. Sin embargo, el aumento de la viscosidad hace muy dificil el procesado a gran escala. Un metodo alternativo sencillo y rapido para preparar plasmidos comprende el tratamiento de las bacterias con lisozima, despues hervirlas a aproximadamente 100º C en un tampón adecuado durante de 20 a 40 segundos formando un grumo insoluble de ADN genómico, proteina y restos celulares permaneciendo el plasmido en disolución con ARN como contaminante principal. Despues, se anade una disolución mezclada de NaOH y dodecilsulfato s6dico (SDS) con el fin de disolver 45 la membrana citoplasmica. NaOH desnaturaliza parcialmente los ADN y degrada parcialmente los ARN y SDS actua para disolver la membrana y desnaturalizar las proteinas. Sucesivamente, el complejo SDS-proteina y los restos celulares se precipitan mediante la adición de acetato de potasio 5N (pH 4, 8) . En este momento, el pH es importante tanto para neutralizar el NaOH utilizado en dicha manipulación como para renaturalizar el plasmido. Sin embargo, esta tecnica no es apropiada para aumentar la escala hasta fermentaciones bacterianas de gran volumen y se 50 pretende que sea para fermentaciones de menos de cinco litros. Posteriormente, se aplica una centrifugación para eliminar los precipitados, obteniendose asi los plasmidos deseados en el sobrenadante. Esta serie de manipulaciones tambien requiere una mezcla lenta y firme, con el fin de evitar que el ADN cromos6mico bacteriano se rompa en fragmentos pequenos y agregue, produciendo la contaminación del plasmido y dificultando la realización del procesamiento a gran escala.

55 Un metodo alternativo habitual para lisar las celulas, conocido como lisis alcalina, consiste en mezclar una suspensión de celulas bacterianas (disolución 1) con una disolución de lisis alcalina (disolución 2) . La disolución 2 consiste en un detergente, por ejemplo, dodecil sulfato s6dico (SDS) para lisar las celulas bacterianas y liberar el material intracelular y un alcali, por ejemplo, hidróxido s6dico para desnaturalizar las proteinas y acidos nucleicos de

las celulas (particularmente ADNg y ARN) . Al lisarse las celulas y desnaturalizarse el ADN, la viscosidad de la disolución aumenta en gran medida. Despues de la desnaturalización, se anade una disolución acida, por ejemplo, acetato de potasio (disolución 3) , para neutralizar el hidróxido s6dico induciendo la renaturalización de los acidos nucleicos. Los fragmentos largos de ADNg se vuelven a asociar al azar y forman redes que precipitan como fl6culos, atrapando proteinas, lipidos y otros acidos nucleicos. La sal de potasio del dodecilsulfato tambien precipita eliminando las proteinas a las que esta asociada. Las dos hebras de ADNp (ADN plasmidico) , se entrelazan entre si, se reasocian normalmente para volver a formar el plasmido inicial que permanece en disolución.

La tecnica anterior describe de forma general esta tecnica de lisis en modo discontinuo, es decir, en el que se mezclan diferentes disoluciones mediante la adición secuencial de las disoluciones a recipientes o tanques. Debido a que el lisado alcalino es un fluido viscoelastico que es muy dificil de manipular, una dificultad con este metodo se produce durante el mezclado de las diferentes disoluciones. Debido a que el esfuerzo de cizalla produce la fragmentación del ADNg, lo que hace que sea muy dificil de separar del ADNp, se necesitan metodos para evitar la aplicación de esfuerzos de cizalla al fluido. Ademas, el ADNp largo (es decir, mayor de aproximadamente 10 pares de kilo bases) tambien es susceptible al dano por cizalla durante el proceso de mezclado. Despues de que la disolución que contiene la suspensión celular se ha mezclado con la disolución de lisis, se mezcla el lisado alcalino viscoelastico con la disolución de neutralización. De nuevo, este proceso de mezclado resulta problematico debido a las propiedades viscoelasticas de la disolución.

Ademas, otra dificultad para aumentar la escala del proceso de lisis discontinuo implica la eficacia del mezclado de los diferentes fluidos cuando se intentan limitar los esfuerzos de cizalla para evitar la fragmentación del ADNg. Como se ha indicado previamente, el comportamiento cromatografico del ADN genómico fragmentado es muy similar al del ADNp, de manera que se vuelve practicamente imposible deshacerse del ADNg mediante los procedimientos de purificación estandar. Por lo tanto, resultan claras varias limitaciones relacionadas con la utilización de este procedimiento discontinuo para lisar celulas bacterianas, tales como aumento de escala, baja calidad del ADNp recuperado debido a la contaminación con ADNg fragmentado y la cantidad relativamente baja del ADNp obtenido.

A diferencia del metodo discontinuo, se han propuesto varios metodos para mezclar de manera continua varias disoluciones de lisis... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo de lisis celular alcalina continua que comprende:

- un primer mezclador o inyector capaz de inyectar una disolución de lisado en la dirección opuesta de una suspensión celular;

- un primer tubo de pequeno diametro para generar un flujo turbulento dentro de la mezcla;

- un segundo tubo de gran diametro para generar un flujo laminar dentro de la mezcla;

- un segundo mezclador o inyector para inyectar la disolución neutralizante en un extremo y recoger en el otro extremo la mezcla.

2. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde se selecciona el diametro de los tubos e inyectores para controlar los caudales de las mezclas dentro de flujos turbulentos y laminares.

3. El dispositivo de lisis celular alcalina continua de la reivindicación 1 o 2, que ademas comprende una bomba para inyectar o bombear la suspensión celular para ponerla en contacto en la dirección contraria con la disolución celular.

4. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el primer mezclador o inyector es un mezclador o inyector en linea.

5. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde el primer mezclador es un tubo en T.

6. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde la mezcla de la suspensión celular y la disolución de lisado fluyen a traves del primer tubo bajo un flujo turbulento durante corto tiempo.

7. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde el primer tubo tiene un diametro inferior a 1cm, preferiblemente entre 2 y 8 mm, y mas preferiblemente alrededor de 6 mm, y una longitud de 1 a 10 m, y preferiblemente de 2 a 6m.

8. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde la mezcla se somete al flujo turbulento durante 1 a 10 s, y preferiblemente de 2 a 5 s, y mas preferiblemente 2, 5 s.

9. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el segundo tubo es un tubo en serpentin capaz de generar un flujo laminar para permitir el contacto continuo de la disolución alcalina y la suspensión celular y para asegurar la lisis celular completa.

10. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el periodo de contacto continuo es de entre 30 s a 2 min, preferiblemente entre 1 min a 1 min 30 s, y preferiblemente de 1min 20s.

11. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde el segundo tubo tiene un diametro inferior a 1cm, preferiblemente entre 10 y 20mm, o entre 12, 5 y 19 mm, y mas preferiblemente igual a 16mm, y una longitud de 5 a 30 m, y preferiblemente de 13 a 23 m.

12. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en donde el tercer tubo tiene un diametro inferior a 1cm, preferiblemente entre 2 a 10 mm, mas preferiblemente entre 5 a 8 mm, y una longitud entre 1 a 10 m y mas preferiblemente entre 2 a 4 m.

13. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en donde el segundo mezclador o inyector tiene forma de Y y en linea con las celulas lisadas para inyectar una disolución resultante en la precipitación de un ADN, ARN genómico, y proteinas.

14. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que se conecta de forma operable a un tanque para fermentación.

15. Un metodo de lisado de celulas que comprende hacer fluir las celulas a traves de un dispositivo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. El metodo de la reivindicación 15, en el que la disolución de lisis es una disolución que contiene un agente de lisis seleccionado del grupo que consiste en un alcali, un detergente, un disolvente organico y una enzima o una mezcla de estos.

17. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 15 y 16 que ademas comprende al menos dos etapas cromatograficas seleccionada de cromatografia de intercambio iónico, cromatografia de afinidad de triple helice y cromatografia de interacción hidrof6bica.

18. El metodo de la reivindicación 17 en donde la cromatografia de intercambio iónico, la cromatografia de afinidad de triple helice y la cromatografia de interacción hidrof6bica ocurren en ese orden.

19. El metodo de la reivindicación 17, en el que la primera cromatografia realizada esta precedida de una filtración del lisado.

20. El metodo de la reivindicación 17, en el que la primera cromatografia realizada esta precedida de la eliminación del fl6culo.

21. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, que es susceptible de incrementar su escala hasta la fabricación a gran escala.

22. Un metodo a gran escala de fabricación de ADN plasmidico de elevada pureza, en el que las celulas hospedantes que contienen plasmido se hacen fluir a traves de un medio para flujo turbulento para mezclar rapidamente una suspensión celular con una disolución que lisa las celulas; (b) a continuación las celulas se hacen fluir a traves de un pedio para flujo laminar para permitir incubar una mezcla formada en (a) sin agitación sustancial, en donde la mezcla de celulas formada en (a) a continuación se hace fluir desde el medio para flujo turbulento hacia el medio para flujo laminar y (c) se pone en contacto a traves de un medio para anadir una segunda disolución que neutraliza la disolución de lisado, en donde la mezcla de celulas incubadas en (b) fluye des desde le medio para flujo laminar hacia el medio para anadir una segunda disolución, y los plasmidos tal como se liberan de las celulas se separan por cromatografia de intercambio iónico, cromatografia de afinidad de triple helice y cromatografia de interacción hidrof6bica que se producen en ese orden.

23. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, que comprende ademas una etapa anterior de eliminación del fl6culo haciendo pasar la disolución a traves de un filtro de rejilla y mediante una filtración de profundidad.

24. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, que comprende ademas una etapa de diafiltración despues de la ultima etapa cromatografica.

25. El metodo de la reivindicación 24, en donde la etapa de diafiltración es para obtener la sal, tampón y valores de pH apropiados.

26. El metodo de la reivindicación 24 o 25, en donde la etapa de diafiltración comprende las etapas siguientes:

recoger la disolución de la ultima etapa cromatografica;

realizar una primera etapa de diafiltración frente a tampón Tris/NaCl;

realizar una segunda etapa de diafiltración frente a disolución salina en condiciones adecuadas para controlar la concentración final del tampón y para estabilizar el pH de la formulación final de ADN plasmidico.

27. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 26, en el que las etapas cromatograficas se realizan en soporte sólido que es cualquier material organico, inorganico o compuesto, poroso, superporoso o no poroso, adecuado para separaciones cromatograficas, que esta derivatizado con poli (alquenglicoles) , alcanos, alquenos, alquinos, arenos u otras moleculas que confieren un caracter hidrof6bico al soporte.

28. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 15 a 26, en el que la cromatografia de interacción hidrof6bica se realiza en un lecho fijo o en un lecho expandido.

FIGURA 1

FIGURA 2

VISTA GENERAL DEL MEZCLADOR M1

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