La invención se relaciona con variantes del dominio N-terminal de activación de transcripción de p300 que presentan mutaciones en los sitios de fosforilación dando lugar a mutantes no fosforilables y que carecen de actividad transcripcional o de mutantes que mimetizan restos residuos fosforilados dando lugar a variantes constitutivamente activas de p300.

Las variantes de p300 se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer, enfermedades autoinmunes, infecciones, etc

Composiciones y métodos para inhibir la actividad de p300.

Campo técnico de la invención

La invención se relaciona con composiciones útiles para el tratamiento de enfermedades asociadas con una activación o una inhibición indeseadas de factores de transcripción que requieren de p300 como co-activador. En particular, las composiciones de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer, enfermedades autoinmunes, infecciones, etc.

Antecedentes de la invención

Las proteínas p300 y CBP son importantes reguladores de la transcripción inducible en células eucariotas. Estas proteínas fueron identificadas originalmente como proteínas que interaccionaban con el factor de transcripción CREM y con la proteína adenoviral E1A. Los co-activadores actúan de dos formas distintas. Por un lado, actúan como un puente molecular conectando los factores de transcripción con la maquinaria transcripcional, incluyendo TBP, TFIIIB, TFIID y la ARN polimerasa II. Por otro lado, CBP y p300 son capaces de acevilar histonas en la cromatina del promotor diana gracias a la actividad histona acetiltransferasa (HAT) presente en su región C-terminal, lo que provoca un cambio conformacional en la cromatina adquiriendo una estructura abiertas CBP/p300 interaccionan con y aumentan la transactivación de una variedad de factores de transcripción, incluyendo p53, factores de la familia E2F, CREB, NF-AT, NF-κB y AP-1, coordinando la transcripción de los genes dianas. Por tanto, CBP y p300 están implicados en la regulación de múltiples procesos celulares, incluyendo proliferación, diferenciación, supresión tumoral, transformación maligna y varias alteraciones inmunológicas.

Por tanto, resulta de interés el disponer de agentes que permiten modular la actividad de p300, tanto mediante su estimulación como mediante su inhibición. Inhibidores de la actividad transcripcional de p300 basados en la inhibición de la actividad acetil transferasa han sido descritos en el estado de la técnica. Así, WO03027279 describe una histona acetiltransferasa, Zheng et al. (J. Am. Chem. Soc. 2005 Dec 14;127(49):17182-3) han descrito un inhibidor de la actividad histona acetiltransferasa de p300 formado por un análogo de coenzima A acoplado mediante un puente disulfuro a un resto de oligoarginina que promueve el transporte a través de membranas; Balasubramanyam, K. et al (J. Biol. Chem. 279:51163-71) han descrito la capacidad de la curcumina de inhibir la actividad histona acetiltransferasa de p300; Stimson et al (Mol. Cancer Ther., 2005, 10:1521-32) han descrito compuestos isotiazolónicos que inhiben la actividad histona acetiltransferasa de p300 y la solicitud de patente japonesa JP2000139464 describe oligonucleótidos antisentido dirigidos contra p300 y CBP y su uso para el tratamiento de la leucemia.

CBP/p300 contienen dos dominios que presentan actividad transcripcional, uno de ellos localizado en el extremo N-terminal y el otro en el extremo C-terminal, que pueden actuar independientemente e interaccionar simultáneamente con la maquinaria transcripcional y/o con diferentes factores de transcripción para generar la actividad transcripcional mediada por co-activadores. La transactivación mediante por CBP y p300 se regula a través de múltiples vías de señalización que resultan en distintos tipos de modificaciones post-traduccionales de los dominios de transactivación, incluyendo sumoilación, fosforilación, metilación y auto-acetilación. Entre ellas, la forsforilación parece ser una de las modificaciones de mayor importancia dado que la actividad HAT de CBP y p300 se ve aumentada por la quinasas MAP p42 y o44, CaMK IV, PKA, Akt y IKK-alpha. Por otro lado, la actividad transcripcional de CBP/p300 está controlada negativamente por el complejo ciclina e/cdk-2 o por la fosforilación por la proteína quinasa delta (PKC-δ).

Por tanto, es posible regular la actividad de p300 mediante la modificación del estado de fosforilación. Sin embargo, a pesar de que se conoce la relación entre fosforilación y actividad, los sitios exactos de fosforilación y las quinasas responsables son desconocidos. Yuan et al (Biochim Biophys Acta. 2002, 1592:205-11) han descrito la capacidad de la proteína quinasa delta de fosforilar la serina en posición 89 de p300 provocando la inhibición de la actividad histona acetiltransferasa.

Por tanto, existe una necesidad en la de técnica de agentes capaces de modificar los patrones fisiológicos de fosforilación de la proteína p300/CBP y que permitan regular a voluntad la actividad de p300.

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:1 (amino ácidos 192 a 703 de la proteína p300 humana) o una variante de la misma que muestra al menos un 80% de identidad de secuencia y que carece de actividad trans-activadora de la transcripción.

En otro aspecto la invención se relaciona con un polipéptido que comprende una variante de la secuencia SEQ ID NO:1 (amino ácidos 192 a 703 de la proteína p300 humana) cuya actividad trans-activadora de la transcripción se encuentra constitutivamente activada.

En aspectos adicionales, la invención se relaciona con construcciones génicas que comprenden los polinucleótidos de la invención, con vectores que comprenden los polinucleótido de la invención o las construcciones génicas de la invención, con células que comprende los polipéptidos de la invención, los polinucleótidos de la invención, los vectores de la invención o las construcciones génicas de la invención y con animales transgénicos no humano que comprende, integrado en su genoma, los polinucleótidos de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido de la invención, con un polinucleótido de la invención, con una construcción génica de la invención, con un vector de la invención para su uso en medicina.

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma que muestra al menos un 80% de identidad de secuencia y que carece de actividad trans-activadora de la transcripción para el tratamiento de enfermedades causados por una activación indeseada de las proteínas p300, NF-κB, NFAT y/o c-jun.

En otro aspecto la invención se relaciona con un polipéptido que comprende una variante de la secuencia SEQ ID NO:1 cuya actividad trans-activadora de la transcripción se encuentra constitutivamente activada para el tratamiento de enfermedades causados por una inhibición indeseada de las proteínas p300, NF-κB, NFAT y/o c-jun.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. La proteína viral A238L inhibe la interacción entre el extremo N-terminal TAD de p300 y PKC. Células Jurkat-pcDNA y Jurkat-A238L se transfectaron con diferentes mutantes GAL4-p300. A, GAL4-p300 FL; B, GAL4-p300 1-1301; C, GAL4-p300 192-703; y D, GAL4-p300 1239-2414, como se ha descrito en Materiales y Métodos. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se incubaron en ausencia o presencia de PMA/Ion durante 4 h, y los extractos nucleares se inmunoprecipitaron con 4 μg de anticuerpo policlonal de conejo contra PKC, o con IgG como control negativo. Los inmunopreipitados se analizaron por Western Blot con el mismo anticuerpo (αPKC) para determinar los niveles de proteínas en el precipitado, y con anti-GAL4 (αGAL4) para detectar los niveles de PKC asociada con la correspondiente forma mutante de p300. El análisis densitométrico muestra la relación entre PKC coinmunoprecipitada y p300 presente en el precipitado, de tres experimentos independientes (mean pm S.D). E, La inmunoprecipitación de PKC se analizó por Western blot con un anticuerpo anti-SV5 para detectar los niveles de A238L-SV5 asosciada a PKC. El análisis densitométrico muestra la relación entre A238L coinmunoprercipitada y PKC presente en el precipitado, de tres experimentos independientes (mean pm S.D). F, En paralelo, la PKC inmunoprecipitada se usó en un ensayo kinasa in vitro, utilizando como sustrato MBP purificado. Las proteínas se separaron mediante un gel de poliacrilamida SDS-PAGE al 12% y se reveló mediante autoradiografía. El análisis densitométrico muestra la relación entre MBP [³²P] fosforilado y PKC inmunoprecipitada, de tres experimentos independientes (mean pm S.D).

Figura 2. La fosforilación de la Serina 384 por PKC-θ, representa un paso esencial en la activación...

1. Un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:1 o una variante de la misma que muestra al menos un 80% de identidad de secuencia y que carece de actividad trans-activadora de la transcripción.

2. Un polipéptido según la reivindicación 1 en el que el amino ácido en posición 193 de SEQ ID NO:1 no es un amino ácido fosforilable ni un análogo estructural de un fosfoaminoácido.

3. Un polipéptido según la reivindicación 2 en donde el amino ácido en posición 193 en la secuencia de SEQ ID NO:1 es Ala.

4. Un polinucleótido que codifica un polipéptido tal que definido en las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una construcción génica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 4.

6. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 4 o una construcción génica según la reivindicación 5.

7. Una célula que comprende un polipéptido según la reivindicación 1 a 3, un polinucleótido según la reivindicación 4, una construcción génica según la reivindicación 5 o un vector según la reivindicación 6.

8. Un animal transgénico no humano que comprende, integrado en su genoma, un ácido nucleico según la reivindicación 4.

9. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido según la reivindicación 4, una construcción génica según la reivindicación 5 o un vector según la reivindicación 6 para su uso en medicina.

10. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido según la reivindicación 4, una construcción génica según la reivindicación 5 o un vector según la reivindicación 6 junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido según la reivindicación 4, una construcción génica según la reivindicación 5 o un vector según la reivindicación 6 para el tratamiento de trastornos causados por una activación indeseada de las proteínas p300, NF-κB, NFAT y/o c-jun.

12. Un polipéptido, polinucleótido, construcción génica o vector según la reivindicación 11 en donde la enfermedad está causada por una activación indeseada de NF-κB.

13. Un polipéptido, polinucleótido, construcción génica o vector según la reivindicación 12 en donde la enfermedad causada por una activación indeseada de NF-κB se selecciona del grupo de una enfermedad inflamatoria y una enfermedad autoinmune.