Un polipéptido que tiene una actividad de proteína TIF2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en:

(a) aminoácidos 1 a 1464 de la SEC ID Nº: 2; (b) la secuencia de aminoácidos completa tal como ha codificado el ADNc contenido en el Nº de Depósito ATCC 97612; (c) aminoácidos 624 a 869 de la SEC ID Nº: 2; (d) aminoácidos 624 a 1131 de la SEC ID Nº: 2; (e) aminoácidos 1410 a 1131 de la SEC ID Nº: 2; (f) aminoácidos 1288 a 1464 de la SEC ID Nº: 2; (g) aminoácidos 624 a 1287 de la SEC ID Nº: 2; (h) aminoácidos 624 a 1179 de la SEC ID Nº: 2; (i) aminoácidos 624 a 1010 de la SEC ID Nº: 2; (j) aminoácidos 870 a 1179 de la SEC ID Nº: 2; (k) aminoácidos 1010 a 1179 de la SEC ID Nº: 2; (l) aminoácidos 940 a 1179 de la SEC ID Nº: 2; (m) aminoácidos 940 a 1131 de la SEC ID Nº: 2 y (n) una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a una cualquiera de (a)­ (m); en el que dicha actividad de TIF2 se selecciona del grupo que consiste en: unión a un receptor nuclear y potenciamiento de la transcripción

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a un mediador transcripcional de receptor nuclear (RN). Más específicamente, se dan a conocer moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican factor intermediario transcripcional 2 (TIF2). Los procedimientos recombinantes para producir polipéptidos TIF2 también se dan a conocer ya que son procedimientos de exploración para identificar agonistas y antagonistas de la función de activación AF-2 de receptores nucleares, así como anticuerpos TIF2. También se dan a conocer procedimientos de exploración para identificar agonistas y antagonistas de la actividad del dominio de activación AD1 de TIF2, así como se dan a conocer procedimientos de exploración para identificar agonistas y antagonistas de la actividad del dominio de activación AD2 de TIF2. Antecedentes de la Invención

Los activadores que potencian la iniciación de la transcripción por ARN polimerasa B (II) están compuestos de al menos dos dominios funcionales: un dominio de unión a ADN y un dominio de activación (M. Ptashne, Nature 335: 683-689 (1988); P. J. Mitchell y col., Science

245: 371-378 (1989)). Estos dos dominios son generalmente unidades funcionales separables y cada una puede de hecho intercambiarse con la región complementaria de un activador no relacionado, produciendo por lo tanto activadores quiméricos funcionales (S. Green y col., Nature 325: 75-78 (1987)).

Se han realizado varios análisis de función-estructura de la transcripción de eucariotas, centrándose principalmente en las proteínas de levadura GAL4 y GUN4 y en miembros de la familia de receptores nucleares. Las proteínas GAL4 y GCN4 activan la transcripción uniéndose a secuencias de activación cadena arriba específicas, que tienen muchas de las características de elementos potenciadores de eucariotas superiores (K. Struhl, Cell 49: 295297 (1987)). El activador de herpes simplex VP16 representa otro tipo de activador, que activa la transcripción uniéndose al factor de transcripción del octámero unido a ADN en lugar de unirse al ADN directamente (T. Gerster y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 6347-6351 (1988)).

La familia de los receptores nucleares que incluye receptores de hormonas esteroideas, hormonas tiroideas, vitamina D y el derivado de vitamina A ácido retinoico, son también factores que potencian la transcripción que se unen a ADN directamente en presencia de su ligando afín por reconocimiento de elementos potenciadores específicos, es decir, elementos sensibles a hormona o ligando (R. M. Evans, Cell 240: 889-895 (1988)). Estos ligandos afines tienden a ser moléculas pequeñas hidrófobas, que incluyen hormonas esteroideas tales como estrógeno y progesterona, hormona tiroidea, vitamina D y varios retinoides (S. Halachmi y col.,

Science 264: 1455-1458 (1994); Gronemeyer, H. y Laudet, V., Protein Profile 2: 1173-1308 (1995)).

A pesar de su pequeño tamaño y aparentemente simple estructura, sin embargo, se sabe que los ligandos afines asociados con RN inducen un amplio intervalo de respuestas fisiológicas. Los esteroides adrenales por ejemplo, tales como cortisol y aldosterona, influyen ampliamente en la homeostasis corporal, controlando el glucógeno y metabolismo mineral, tienen efectos generalizados en los sistemas inmune y nervioso e influyen sobre el crecimiento y diferenciación de células en cultivo. Las hormonas sexuales (progesterona, estrógenos y testosterona) provocan el desarrollo y determinación del sistema reproductor embrionario, feminizan/masculinizan el cerebro al nacimiento, controlan la reproducción y comportamiento relacionado en adultos y son responsables del desarrollo de los caracteres sexuales secundarios. La vitamina D es necesaria para el desarrollo óseo adecuado y desempeña un papel crítico en el metabolismo del calcio y la diferenciación del hueso. Significativamente, la producción aberrante de estas hormonas se ha asociado con un amplio espectro de enfermedades clínicas, incluyendo cáncer y afecciones patológicas similares.

Todos los RN presentan una estructura modular, con de cinco a seis regiones distintas, denominadas A-F. La región N terminal A/B contiene la función de activación AF-1, que puede activar la transcripción constitutivamente. La región C abarca el domino de unión a ADN (DBD), que reconoce elementos que actúan en cis afines. La región E contiene el dominio de unión a ligando (LBD), una superficie de dimerización y la función de activación transcripcional dependiente de ligando AF-2 (revisada en Mangelsdorft, D. J. y col., Cell 83:835-839 (1995a); Mangelsdorft & Evans, Cell 83: 841-850 (1995b); Beato, M. y col., Cell 83: 851-857 (1995); Gronemeyer & Laudet, "Transcription Factors 3: Nuclear Receptors", in Protein Profile, vol. 2, Academic Press (1995); Kastner, P. y col., EMBD J. 11: 629-642 (1992); Chambon, P., FASEB J 10: 940-954 (1996)).

Varias clases de dominios en activadores son capaces de mediar la activación transcripcional. Los activadores de levadura GAL4 y GCN4 y VP16 de herpes simplex contienen todos dominios de activación que están compuestos de secuencias de aminoácidos ácidas, que pueden actuar formando hélices α anfipáticas (I. A. Hope y col., Cell 46: 885-894 (1986); J. Ma y col., Cell 48: 847-853 (1987); E. Giniger y col., Nature 330: 670-672 (1987); S.

J. Triezenberg y col., Genes Dev. 2: 718-729 (1988)). Las funciones de activación de proteínas humanas Sp1 y CTF/NPI contienen áreas ricas en glutamina y prolina, respectivamente (A. J. Courey y col., Cell 55: 887-898 (1988); N. Mermod y col., Cell 58: 741-753 (1989)). Los estudios con receptores de hormonas esteroideas han mostrado que tanto el dominio N terminal A/B como el dominio de unión a hormona (HBD) C terminal contienen funciones de activación de la transcripción (AF) (M. T. Bocquel y col., Nucl. Acids Res., 17: 2581-2595 (1989); L. Tora y col., Cell 59: 477-487 (1989)). Las AF del receptor de estrógenos humano (hER) no contienen secuencias de aminoácidos ácidos (S. Halachmi y col., Science 264: 14551458 (1994)). Por el contrario, sin embargo, el receptor de glucocorticoides humano (hGR) contiene dos funciones de activación τ-1(localizado en el domino A/B) y τ-2 (localizado en la región N terminal del HBD), ambos de los cuales son ácidos (S. M. Hollenberg y col., Cell 55: 899-906 (1988)).

A partir de los resultados de estudio sobre interferencia/silenciamiento transcripcional entre receptores nucleares y sobre estimulación homo y heterosinérgica de iniciación de la transcripción a partir de promotores mínimos por las funciones de activación presentes en hER (AF-1 y AF-2) y el activador ácido VP16, se ha propuesto que las AF pueden activar la transcripción interaccionando con diferentes componentes del complejo de iniciación básico (Bocquel y col., Nucl. Acids. Res. 17: 2581-2595 (1989); Meyer y col., Cell 57: 433-442 (1989),

L. Tora y col., Cell 59: 477-487 (1989)). Los estudios de las propiedades de interferencia/silenciamiento transcripcional de AAD, hER AF-1 y hER AF-2, sin embargo, mostraron que tanto hER AF-1 como AF-2 pueden silenciar activadores ácidos, tales como VP16, pero que lo contrario no era cierto, es decir, AAD no silencia hER AF-1 o AF-2. Sin embargo, hER AF-1 y AF-2, que se distinguen claramente por sus propiedades sinérgicas, sin embargo se silenciaban entre ellos (D. Tasset y col., Cell 62: 1177-1187 (1990)).

Basándose en estos resultados, se propuso que existe una serie de factores intermediarios transcripcionales (TIF), interpuesta entre factores potenciadores y los factores transcripcionales básicos. Por ejemplo, se ha sugerido que AF-1 y AF-2 se ponen en contacto con la serie de TIF a puntos funcionalmente equivalentes, mientras que se cree que AAD interaccionan en un punto más temprano en la serie (D. Tasset y col., Cell 62: 11771187(1990)).

Se han caracterizado varios TIF coactivadores potenciales para RN AF-2 (véase Chambon, P., FASEB J 10: 940-954 (1996); Glass, C. K. y col., Current Opin. Cell Biol. 9: 222232 (1997); Horwitz, K. B. y col., Mol. Endocrinol. 10: 1167-1177 (1996) para revisiones recientes). Voegel. J. y col., EMBO J. 15: 3667-3675(1996) han clonado un TIF2 de longitud completa que exhibe las propiedades esperadas para un mediador de AF-2. LeDouarin, B. y col., EMBO J. 15: 6701-6715 (1996) han demostrado que un fragmento de 10 aminoácidos de TIF1α es necesario y suficiente para mediar la interacción con RXR en un ligando de un modo dependiente de integridad de AF-2 y ligando. Notablemente, dentro de este fragmento...

1. Un polipéptido que tiene una actividad de proteína TIF2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en:

(a) aminoácidos 1 a 1464 de la SEC ID Nº: 2;

(b) la secuencia de aminoácidos completa tal como ha codificado el ADNc contenido en el Nº de Depósito ATCC 97612;

(c) aminoácidos 624 a 869 de la SEC ID Nº: 2;

(d) aminoácidos 624 a 1131 de la SEC ID Nº: 2;

(e) aminoácidos 1410 a 1131 de la SEC ID Nº: 2;

(f) aminoácidos 1288 a 1464 de la SEC ID Nº: 2;

(g) aminoácidos 624 a 1287 de la SEC ID Nº: 2;

(h) aminoácidos 624 a 1179 de la SEC ID Nº: 2;

(i) aminoácidos 624 a 1010 de la SEC ID Nº: 2;

(j) aminoácidos 870 a 1179 de la SEC ID Nº: 2;

(k) aminoácidos 1010 a 1179 de la SEC ID Nº: 2;

(l) aminoácidos 940 a 1179 de la SEC ID Nº: 2;

(m) aminoácidos 940 a 1131 de la SEC ID Nº: 2 y

(n) una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a una cualquiera de (a)

(m); en el que dicha actividad de TIF2 se selecciona del grupo que consiste en: unión a un receptor nuclear y potenciamiento de la transcripción.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de (n) es al menos el 95 % idéntica a una cualquiera de (a)-(m).

3. El polipéptido de la reivindicación 1 ó 2, que es producida por una célula huésped recombinante.