SECUENCIA DE MECP2 SINTÉTICA PARA LA TERAPIA DE SUSTITUCIÓN DE PROTEÍNAS.

Un polipéptido que comprende (i) una proteína MeCP2 o fragmento biológicamente activo o un derivado de dicha proteína o fragmento,

y (ii) un dominio de transducción de la proteína, en donde la proteína MeCP2 se fusiona con el dominio de transducción de la proteína, para utilizar en un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa o una enfermedad del desarrollo neurológico; en donde dicho fragmento comprende al menos 150 aminoácidos de la proteína MeCP2; y en donde dicho derivado de dicha proteína o fragmento tiene al menos 60% de identidad con dicha proteína MeCP2 o fragmento de esta; y en donde dicho fragmento o dicho derivado tiene al menos 60 % de dicha actividad biológica, según se determina por un ensayo de transcripción in vitro descrito por Nan, X et al., Cell 88: 471-481 (1997)

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con la proteína MeCP2 y su uso en terapia de la sustitución de la proteína, según se define en las reivindicaciones. Más específicamente, las secuencias del ácido nucleico optimizadas del codón para la expresión de las proteínas MeCP2, los métodos para fabricar dicha secuencia del ácido nucleico y que expresa dicha proteína, las fusiones de una proteína de la invención con un dominio de transducción, y los vectores y las células huésped que comprenden una proteína de la invención se describen. Se describen otros usos de los ácidos nucleicos o las proteínas de la invención en la medicina, las composiciones farmacéuticas que comprenden las secuencias del ácido nucleico y las proteínas de la invención, también como los métodos para el tratamiento, prevención, y/o terapia de enfermedades neurodegenerativas o del desarrollo neurológico, incluyendo el síndrome de Rett.

Antecedentes de la invención

El síndrome de Rett (RTT), es un trastorno progresivo del desarrollo neurológico. Este afecta casi exclusivamente a las mujeres (Rett, 1966, Wien Med Wochenschr .116:723-6) y es una de las causas más comunes de retraso mental en las mujeres. RTT se caracteriza por un curso clínico de forma dinámica con cuatro etapas consecutivas. Durante la Etapa I (edad 6-18 meses), las chicas dejan de adquirir nuevas habilidades; mostrando una desaceleración del crecimiento de la cabeza y rasgos autistas tales como retraimiento emocional y contacto visual disminuido En la Etapa II (edad 1-4 años), los niños afectados pierden las habilidades aprendidas tales como el habla y el uso de la mano intencional. Desarrollan patrones de respiración irregulares, ataxia/apraxia del modo de andar y del tronco, y movimientos de la mano en forma estereotípica. Aproximadamente la mitad de las chicas también desarrollan convulsiones y existe alguna estabilización de la enfermedad durante la Etapa III (edad 4-7 años). Las convulsiones se hacen menos frecuentes durante la Etapa IV (edad 5-15 años y mayores), pero el deterioro motor continúa. La hipoactividad, especialmente entre aquellos que no caminan, contribuye al desarrollo frecuente de escoliosis, que pueden causar que las chicas se confinen a las sillas de ruedas. Las características neuropatológicas de los pacientes con Rett, incluyen una disminución en el espesor cortical también una reducción del tamaño neuronal cortical. Una fuerte reducción de la arborización dendrítica también ha sido descrita, pero ninguna de las características morfológicas gruesas se afectan (Armstrong, 2002, Ment Retard Dev Disabil Res Rev 8:72-6). RTT es una enfermedad ligada a X con una incidencia estimada de 1:10,000 a 1:15,000. Amir et al. (1999) (Nat Genet 23:185-8), han identificado mutaciones en el gen MECP2 como la causa de RTT. El gen MECP2 se somete a la inactivación de X. Por consiguiente, los heterocigotos hembras mutantes son mosaicos para la deficiencia de MeCP2 y este es más probablemente uno de los factores que modulan la influencia del fenotipo de la enfermedad. Los hombres que cumplen el criterio clínico para el síndrome de Rett han sido identificados en asociación con un cariotipo 47, XXY y a partir de mutaciones postcigóticas de MECP2 que dan lugar a mosaicismo somático. Para referencia, ver L. S. Weaving et al.: Journal of Medical Genetics 2005; 42:1-7; and G. Miltenberger- Miltenyi, F. Laccone: Human Mutation 2003 Volume 22, Issue 2; 107-115.

El gen MECP2 se localiza en brazo largo del cromosoma X, en la posición Xq28 (Adler 1995, Mamm Genome 6(8):491-2). El gen abarca 76 kb y se compone de cuatro exones. El gen MECP2 codifica para una proteína llamada proteína 2 de enlace metil-CpG (MeCP2), que se cree que juega un papel esencial en el silenciamiento de otros genes. La proteína MeCP2 tiene dos isoformas, MeCP2 e1 y MeCP2 e2, antes llamadas MeCP2B y MeCP2A, respectivamente (Mnatzakanian et al. 2004, Nat Genet 36:339-41). La isoforma e1 está compuesta de 498 aminoácidos y la isoforma e2 tiene 486 aminoácidos de largo. La isoforma e1 tiene un péptido distintivo de 21aminoácidos en el terminal N, incluyendo tractos polialanina y poliglicina. El ARNm de la variante MECP2 e1 tiene una expresión 10-veces mayor en el cerebro que aquella de la MECP2 e2 y es la isoforma de proteína más abundante en cerebro de ratón y humano. MeCP2 es una proteína de mamífero abundante, que une selectivamente los residuos 5-metil citosina en dinucleótidos posicionados simétricamente. Los dinucleótidos CpG se localizan preferencialmente en las regiones promotoras de los genes. Representan uno de los elementos para la regulación de los genes que se dirigen de los factores de silenciamiento transcripcional después de la metilación de ADN.

No se conoce aún un tratamiento exitoso para mejorar los resultados neurológicos de individuos con síndrome de Rett. De acuerdo con el espectro mutacional del MECP2 en humanos (Lam et al. 2000, J Med Genet 37(12):E41; Lee et al. 2001, Brain Dev 23:S138-43) y los resultados a partir de ratón con RTT, existe un acuerdo general que el síndrome RTT se causa por una pérdida de la función de MeCP2. Una estrategia eficiente que tiene como objetivo almacenar la actividad de MeCP2 debería ser capaz de compensar la pérdida de la función de MeCP2 en células neuronales deficientes. Para referencia, ver L. S. Weaving et al.: Journal of Medical Genetics 2005; 42:1-7; and G. Miltenberger-Miltenyi, F. Laccone: Human Mutation 2003, Volume 22, Issue 2; 107 - 115.

Schwarze et al. (1999, Science 285:1569-1572) reportan que es posible entregar macromoléculas biológicamente activas en las células vivas utilizando un dominio de TAT (proteína transcripcional transactivadora del virus-1 de inmunodeficiencia humana). Muestran la producción de una proteína TAT--galactosidasa recombinante y su inyección vía intraperitoneal en ratones. Encontraron que la proteína de fusión fue distribuida a todos los tejidos incluyendo el cerebro y la proteína de fusión fue biológicamente activa.

WO 00/62067 (Dowdy et al.) reporta el uso de moléculas de proteína transducción (PTD), incluyendo los dominios de la proteína TAT para dirigir las moléculas terapéuticas en el sistema nervioso.

Kosai et al. (Molecular Therapy, Academic Press, San Diego, CA, US, vol. 11, page 24 (August 15, 2008)) revela que RTT es reversible y tratable con terapia génica de MeCP2 en el estriado de ratones.

WO2005/078099 describe las variantes de corte y empalme y su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como el síndrome de Rett. Las proteínas de fusión que comprenden estas variantes de corte y empalme también se contemplan en general, sin embargo, sin revelar o señalar en la presencia en dichas proteínas de fusión de los dominios de las proteínas de transducción.

La producción de proteínas en sistemas de expresión heteróloga (i.e. proteína humana en Escherichia coli) necesita un vector de expresión correspondiente y la secuencia de ADNc del gen de interés. Los 64 codones (tripletes de nucleótidos) del código genético codificados de 20 aminoácidos y de tres señales de parada de la traducción. El código genético por lo tanto es redundante y esto significa que algunos aminoácidos se codifican por más de un codón. La metionina y el triptófano son los únicos aminoácidos codificados por un codón, ATG y TOG, respectivamente, mientras que la arginina, leucina y serina se codifican cada uno por seis codones sinónimos. Debido a que la degeneración del código genético, muchas secuencias alternativas del ácido nucleico codifican la misma proteína. Las frecuencias de los codones de uso varían entre los diferentes organismos. Estas predisposiciones pueden influenciar fuertemente la expresión de las proteínas heterólogas (Kane, 1995, Curr Opin Biotechnol 6(5):494-500). El codón de uso ha sido identificado como el único factor más importante en la expresión de genes procariotas (Lithwick, 2003, Genome Res 13 (12):2665-2673).

Por lo tanto, un objetivo de los actuales inventores es proporcionar construcciones codificantes de proteínas MeCP2 biológicamente activas, que son capaces de entrar en las células del sistema nervioso y compensar de la pérdida de función de MeCP2 de células neuronales afectadas.

Un enfoque terapéutico mediante la entrega de proteínas recombinantes TAT en el cerebro podría tener la tremenda ventaja de una posible traducción rápida a partir del modelo en animales con pacientes. Otras ventajas pueden ser su aplicación de dosificación fácilmente controlable, la eficacia... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende (i) una proteína MeCP2 o fragmento biológicamente activo o un derivado de dicha proteína o fragmento, y (ii) un dominio de transducción de la proteína, en donde la proteína MeCP2 se fusiona con el dominio de transducción de la proteína,

para utilizar en un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa o una enfermedad del desarrollo neurológico; en donde dicho fragmento comprende al menos 150 aminoácidos de la proteína MeCP2; y en donde dicho derivado de dicha proteína o fragmento tiene al menos 60% de identidad con dicha proteína MeCP2 o fragmento de esta; y en donde dicho fragmento o dicho derivado tiene al menos 60 % de dicha actividad biológica, según se determina por un ensayo de transcripción in vitro descrito por Nan, X et al., Cell 88: 471-481 (1997).

2. Un polipéptido que comprende (i) una proteína MeCP2 o un fragmento biológicamente activo o un derivado de dicha proteína o fragmento, y (ii) un dominio de transducción de la proteína, en donde la proteína MeCP2 se fusiona con el dominio de transducción de la proteína,

para utilizar en un método para tratar el síndrome de Rett; en donde dicho fragmento comprende al menos 150 aminoácidos de la proteína MeCP2; y en donde dicho derivado de dicha proteína o fragmento tiene al menos 60 % de identidad con dicha proteína MeCP2 o fragmento de esta; y en donde dicho fragmento o dicho derivado tiene al menos 60% de dicha actividad biológica, según se determina por un ensayo de transcripción in vitro descrito por Nan, X et al., Cell 88: 471-481 (1997).

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde la enfermedad del desarrollo neurológico se debe a una reducción de la expresión de MeCP2 o a una función deteriorada de MeCP2.

4. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el dominio de transducción de la proteína se deriva de la proteína transactivador transcripcional del virus-1 de inmunodeficiencia humana (proteína TAT).

5. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína MeCP2 o fragmento biológicamente activo o derivado de esta es de origen humano.

6. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la proteína MeCP2 o el fragmento biológicamente activo o derivado de esta, es la isoforma e1 de MeCP2 humana o la isoforma e2 de MeCP2 humana

o un fragmento biológicamente activo de esta, o un derivado de dichas isoformas o dichos fragmentos.

7. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho dominio de transducción de la proteína tiene al menos 60%, en particular al menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido del dominio de transducción de la proteína TAT (SEQ ID NO.54).

8. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el tratamiento comprende la administración del polipéptido a un mamífero.

9. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho polipéptido está incluido en una composición farmacéutica.

10. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicha composición farmacéutica se administra a una dosificación de 0.1-200 µg de polipéptido por g de peso corporal del mamífero.

11. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicha composición farmacéutica se administra al menos una vez al día o cada dos días

12. Uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para la fabricación de una composición farmacéutica para la prevención y/o terapia de una enfermedad neurodegenerativa o del desarrollo neurológico.

13. El uso de la reivindicación 12, en donde la enfermedad del desarrollo neurológico se debe a una reducción de la expresión de MeCP2 o con una función deteriorada de MeCP2, particularmente en donde la enfermedad del desarrollo neurológico es el síndrome de Rett.