MÉTODOS Y MATERIALES PARA GENERAR DOMINIOS SH3 CON PROPIEDADES DE UNIÓN SELECCIONADAS.

Métodos y materiales para generar dominios SH3 con propiedades de unión seleccionadas. Campo de la invención Una serie de procesos biológicos que son importantes para estados normales y patológicos se rigen por interacciones de proteínas celulares mediadas por los dominios de la región de homología Src 3 (SH3). Esta revelación corresponde a métodos y materiales para generar dominios SH3 con propiedades de unión diseñadas, y su utilización como herramientas en investigación, terapia, diagnóstico y descubrimiento de fármacos. Antecedentes de la invención Virtualmente todos los aspectos del comportamiento celular, tales como la adaptación de una célula en respuesta a estímulos extracelulares cambiando su patrón de expresión génica, están regulados y ejecutados por proximidad dinámica y ordenada de proteínas celulares. Durante su evolución, han surgido varios tipos diferentes de dominios de proteínas especializadas en mediar tales eventos de interacción proteína-proteína regulados y específicos. Los dominios de proteínas de un tipo forman habitualmente grandes familias de miembros homólogos pero suficientemente divergentes, de tal forma que cada uno de ellos tiene especificidades únicas, aunque a menudo de solapamiento, para la unión del ligando. El dominio SH3 fue identificado por primera vez como una región de homología entre las tirosina quinasas de la familia Src codificado por medio de retrovirus oncogénicos y sus proto-oncogenes celulares equivalentes. A partir de aquí, los dominios SH3 han sido reconocidos en un gran número (>50) de proteínas que cumplen funciones importantes en la regulación del crecimiento celular, diferenciación celular, y otros procesos. Debido a estas funciones los dominios SH3 están muy implicados en la patogénesis de diversas enfermedades, en particular del cáncer. Además, varios patógenos microbianos, tales como el VIH, explotan los procesos mediados por el SH3 como parte de su ciclo de vida. La capacidad de influenciar la formación de un complejo proteico mediado por los dominios SH3 tendría, por lo tanto, un potencial terapéutico significativo. Los dominios SH3 son dominios modulares de proteínas globulares que habitualmente consisten en 50 -70 aminoácidos que se encuentran en diferentes proteínas, particularmente en proteínas implicadas en la transducción de señal celular (Cohen et al. 1995. Cell, 80, 237- 248; Dalgarno et al. 1997. Biopolymers, 43, 383 -400). Los dominios SH3 actúan como mediadores en las interacciones intermoleculares e intramoleculares uniéndose a ligandos que contienen una región con una estructura secundaria conocida como la hélice de poliprolina II (PPII). Estos ligandos pueden unirse a los dominios SH3 en dos orientaciones opuestas, y habitualmente muestran las secuencias consenso del motivo PxxP RXØPXXP y PXØPXR (Ø es un aminoácido hidrofóbico, X es cualquier aminoácido) (Feng et al. 1994. Science, 266, 1241-7; Lim et al. 1994. Nature, 372, 375-9). El posicionamiento del residuo básico conservado (usualmente una arginina; R) en el motivo PxxP dtermina en qué orientación el ligando se une a su dominio SH3 afín. Además, existen ligandos SH3 con hélices PPII que no se ajustan a tales normas de consenso. Un ejemplo a destacar es la región PPII en la Scr, que está implicada en la autoinhibición catalítica al unirse al dominio SH3 de la propia Src, pero contiene sólo una de las dos prolinas que comúnmente definen un motivo PxxP (Xu et al. 1997. Nature, 385, 595-602). La variación de la secuencia en la región de la hélice PPII, que implica la (secuencia) consenso además de las posiciones adyacentes no consenso, ha mostrado ejercer influencia en la especificidad en la formación del complejo ligando/SH3. Se han proporcionado ejemplos de preferencia por dianas con motivos consenso PxxP atípicos por medio de estudios que están dirigidos a la selección de ligandos de Abl SH3 (Feng et al. 1994. Science, 266, 1241- 7; Weng et al. 1995. Moll Cell Biol, 15, 5627-34; Yu et al. 1994. Cell, 76, 933-945), y el complejo péptido CrkN- SH3/C3G (Knudsen et al. 1995. EMBO J, 14, 2191-8; Wu et al. 1995. Structure, 3, 215-226). El efecto de la variación de secuencia que implica los residuos no consenso en la región PPII de los ligandos de SH3 ha sido demostrada de forma óptima mediante experimentos en los que secuencias diana distintivas se han seleccionado para diferentes dominios SH3 de bibliotecas de péptidos aleatorios químicamente sintetizados o expresados en fagos (péptidos de expresión en fagos) (Sparks et al. 1994. J Biol Chem, 269, 23853-6; Viguera et al. Biochemistry, 33, 10925-33; Yu et al. 1994. Cell, 76, 933-45). Sin embargo, a pesar de la evidencia de la especificidad, anteriormente analizada, la afinidad máxima de la unión a SH3 de péptidos ligandos PPII cortos es baja, y las diferencias relativas en su unión a los diferentes dominios SH3 son modestas. Por el contrario, existe una creciente evidencia de que los contactos moleculares en el exterior de la interfaz de la hélice PPII puede proporcionar una especificidad y fuerza significativa a la unión a SH3. La utilización de las bibliotecas de expresión en fagos de péptidos más largos que contienen un motivo PxxP insertado dentro de secuencias aleatorias, ha demostrado que los residuos que los flanquean pueden aumentar la selectividad de tales ligandos, lo que puede poner de manifiesto de 20 a 30 diferencias de plegamiento en su afinidad hacia diferentes dominios SH3 (Rickles et al. 1994. EMBO J, 13, 5598-604; Rickles et al. 1995. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 10909- 2   13; Sparks et al. 1996. Proc Natl Acad Sci USA, 93, 1540-4). El análisis estructural de las interacciones del Src-SH3 con dos dodecapétidos tales reveló que la relativa alta especificidad y afinidad (valores KD 0.54 µM y 1.2 µM) de estas interacciones implicaban contactos entre los residuos que flanquean los péptidos y dos estructuras similares a un lazo en el dominio Src-Sh3, las cuales representan regiones de alta diversidad de secuencia entre los diferentes dominios SH3 y son conocidas como lazos n-src- y RT (Feng et al. 1995. Proc Natl Acad Sci USA, 92, 12408-15). De forma similar, la unión específica de un ligando de Abl SH3 rico en prolina de diseño racional (KD 0.4 µM para Abl vs. 273 µM para Fyn-SH3) podría ser explicada por los correspondientes contactos moleculares con Abl SH3 (Pisabarro y Serrano. 1996. Biochemistry, 35, 10634-40; Pisabarro et al. 1998. J Mol Biol, 281, 513-521). Otra interacción que ha resultado reveladora en elucidar la base de la especificidad de la unión a SH3, que también enfatiza el papel del lazo RT, es el complejo entre la Nef VIH-1 y el dominio SH3 de la tirosina quinasa Hck. La proteína Nef es una proteína miristoilada de 27-34 KDa de los lentivirus de primates (VIH-1, -2, y SIVs), e importante para el desarrollo de alta viremia e inmunodeficiencia en el huésped infectado (Harris. 1996. J Gen Virol, 77, 2379- 92; Saksela. 1997. Front Biosci, 2, 606-618). De manera interesante, la proteína Nef posee características de unión a SH3 notablemente selectivas. Puede unirse estrechamente al Hck-SH3, mostrando valores de afinidad de aproximadamente KD 0.2 µM según se ha medido por resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) (Lee et al. 1995. EMBO J, 14, 5006-15). Por consiguiente, Lee et al. Muestran el importante papel que desempeña la región variable del lazo RT del dominio SH3 de la proteína Hck en relación a la proteína Nef VIH. Por otro lado, Arold et al. (Biochemistry, vol. 37, 1998, 14683- 14691) también analiza el papel que desempeña dicha región, pero indican que en vista de las propiedades de unión la flexibilidad aumentada del lazo RT de la Hck es aún más importante que la variación de aminoácidos en dicha región. En contraste con la fuerte unión a la Hck, la proteína Nef posee una afinidad casi 100 veces menor hacia el dominio SH3, sumamente homólogo, de Fyn. Estudios bioquímicos y estructurales han revelado que la base de esta selectividad reside en la eficiente estrategia de la proteína Nef para el reconocimiento de los residuos SH3 no conservados característicos de Hck, en particular la cadena lateral de una isoleucina localizada en el lazo RT del Hck-SH3 (Lee et al. 1996. Cell, 85, 931-942). La región que aloja el lazo RT del Hck-SH3 está compuesta de múltiples partes no contiguas del polipéptido de la proteína Nef, y está localizado distalmente de la región PPII en la estructura tridimensional de la proteína Nef. Los intentos previos para generar moléculas que podrían competir con las interacciones de SH3 que ocurren de forma natural, se han centrado en el diseño o la selección a partir de bibliotecas aleatorias de péptidos y de moléculas similares a los péptidos que podrían competir con los ligandos PPII para su unión a sus dominios SH3... [Seguir leyendo]

1. Método para generar dominios SH3 con propiedades de unión seleccionadas, que consta de a) Producir una colección de dominios SH3 que contengan mutaciones aleatorizadas en una región variable del lazo RT (dominios RRT-SH3) que corresponda a los residuos de aminoácidos 69 a 74 en la secuencia de la proteína Hck humana, b) Generar bibliotecas recombinantes que expresen dichos dominios RRT-SH3, y c) Someter tales bibliotecas a etapas de afinidad o de selección funcional para identificar dominios SH3 nuevos. 2. El método según la reivindicación 1, en donde el paso a) es efectuado reemplazando los residuos de aminoácidos en la región variable del lazo RT por otros residuos cualquiera de aminoácidos. 3. El método según la reivindicación 2, en donde dichos residuos de aminoácidos en la región variable del lazo RT comprenden seis residuos de aminoácidos que siguen de forma inmediata a una extensión de aminoácidos denominada motivo consenso ALYDY. 4. El método según la reivindicación 1, en donde las bibliotecas recombinantes están seleccionadas de bibliotecas de plásmidos, fagómidos y víricas.   21   22   23   24