Una composición que comprende una partícula vírica, comprendiendo dicha partícula vírica un vector de virus adenoasociado recombinante que comprende al menos dos repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociados,

una secuencia promotora/reguladora, una porción de intrón 1 de un gen del factor IX que tiene una longitud de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 1,7 kb, en la que dicha región de intrón potencia la expresión del factor IX al menos 1,5 veces, una molécula de ADN que codifica el factor IX y regiones sin traducir en 5' y 3' adjuntas y una señal de terminación de la transcripción

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la invención es la terapia génica para el tratamiento de enfermedades que implican una deficiencia de proteínas en la circulación sanguínea. 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El proceso de coagulación de la sangre implica una serie de proteínas conocidas como proteínas de la coagulación de la sangre que actúan en un modo de cascada para efectuar la formación de un coágulo de sangre. La hemofilia es una enfermedad de los seres humanos y otros mamíferos en la que un gen que codifica un factor de coagulación de la sangre contiene una mutación de forma que la proteína codificada no funciona normalmente en el 10 proceso en cascada. Específicamente, la enfermedad hereditaria, la hemofilia B, se caracteriza por una mutación en el gen que codifica la proteína de la coagulación de la sangre, el factor IX (F.IX). El F.IX se revisa en High y col. (1995, "Factor IX" en: Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, High y Roberts, eds., Marcel Dekker, Inc.).

Los vectores adenovíricos son muy conocidos en la terapia génica y se han usado para efectuar la expresión de altos niveles de factor IX canino en ratones inmunodeficientes o en ratones inmunocompetentes cuando el virus se 15 administra conjuntamente con agentes inmunodepresores. Si los vectores adenovíricos se administran a ratones inmunocompetentes en ausencia de agentes inmunodepresores, estos vectores inducen una fuerte respuesta inflamatoria y citotóxica en linfocitos T (CTL) (Dai y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1401-1405) que invalida los efectos beneficiosos de la terapia. Además, hay informes que sugieren que la inyección intramuscular de adenovirus defectuosos en la replicación proporciona expresión a largo plazo de un transgén, siempre que el transgén codifique una 20 autoproteína (es decir, una proteína huésped), de forma que se evita una fuerte respuesta inmunitaria del huésped (Tripathy y col., 1996, Nature Med. 2:545-550; Yang y col., 1996, Hum. Mol. Genet. 5:1703-1712). Por tanto, aunque ha habido un progreso significativo en el área de la terapia génica en la expresión in vivo de un transgén seleccionado tras la inyección directa de un vector adenovírico en músculo esquelético, el uso de vectores adenovíricos puede no ser el procedimiento óptimo para la terapia génica en vista de estas consideraciones inmunológicas. 25

También se han usado experimentalmente vectores retrovíricos como modelo para el tratamiento de hemofilia B. Sin embargo, se informa que los niveles de expresión de F.IX de estos vectores son demasiados bajos para ser de valor terapéutico (Kay y col., 1993, Science 262:117-119).

Se ha demostrado que el ADN de plásmido inyectado en músculo de ratón dirige la expresión de eritropoyetina (Epo) (Tripathy y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10876-10880), pero evidentemente este procedimiento de 30 terapia génica no es suficientemente eficaz para la expresión de un producto génico tal como F.IX, que se necesita a niveles relativamente altos en la circulación (en comparación con Epo) para lograr un efecto terapéutico.

El virus adenoasociado (AAV) es un vehículo alternativo a los adenovirus para la administración de genes al músculo. El AAV recombinante (rAAV) no contiene secuencias que codifiquen proteínas víricas y tiene la posibilidad de integrarse en el ADN cromosómico de la célula huésped (Carter, 1992, Curr. Opin. Biotech. 3:533-539; Skulimowski y 35 col., 1995, Method Mol. Genet. 7:7-12). Ahora están disponibles procedimientos de producción y de purificación que facilitan la generación de rAAV puro que no está significativamente contaminado por AAV natural o adenovirus auxiliar (Skulimowski y col., 1995, anteriormente; Fisher y col., 1996, J. Virol. 70:520-532; Samulski y col., 1989, J. Virol. 63:3822-3828). Como se ha observado en este documento, la administración de adenovirus a mamíferos va acompañada de los problemas inmunológicos anteriormente mencionados. 40

Aunque la eficacia de la transducción in vivo con rAAV en ausencia de virus auxiliar es baja para hepatocitos y células epiteliales de las vías respiratorias (Fisher, 1996, anteriormente), ciertas células posmitóticas tales como neuronas (Kaplitt y col., 1994, Nature Genet. 8:148-154) y fibras de músculo esquelético (Xiao y col., J. Virol. 70:8098-8108) pueden transducirse eficazmente con este vector. Se ha informado de la expresión estable de lacZ durante hasta 1,5 años (Xiao y col., anteriormente). A diferencia de los vectores adenovíricos, la inyección intramuscular con rAAV en 45 animales inmunocompetentes no produce una respuesta de CTL contra fibras de músculo transducido, ni son anticuerpos en circulación contra el producto génico lacZ intracelular presente.

La expresión de la proteína secretada, Epo, tras la inyección intramuscular con rAAV se informa en Kessler y col. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14082-14087). Sin embargo, los niveles de expresión de proteína informada fueron de uno a dos órdenes de magnitud por debajo de los requeridos para un efecto terapéutico mediado por F.IX. 50

La terapia actual para la hemofilia implica la inyección intravenosa de una preparación de concentrados de factores de coagulación siempre que se produzca una hemorragia. Este tratamiento es pesado, inconveniente y muy caro. El paciente promedio paga aproximadamente $100.000 por año sólo por el concentrado. Además, debido a que el concentrado sólo se administra al paciente intermitentemente, los pacientes siguen estando en riesgo de hemorragias potencialmente mortales que son mortales si el tratamiento no se administra oportunamente. 55

Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 94, 1426-1431, Feb. 1997 desvela vectores AAV que codifican el factor IX. Se obtuvieron niveles en plasma del factor IX del orden de hasta 1 ng/ml tras la administración in vivo del vector.

Hay una necesidad sentida desde hace tiempo y la grave necesidad de procedimientos de administración de F.IX a mamíferos que tienen hemofilia, en particular a seres humanos que tienen hemofilia, de forma que se logre un efecto terapéutico. La presente invención satisface esta necesidad. 5

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por tanto, se refiere a los siguientes puntos.

1. Una composición que comprende una partícula vírica, comprendiendo dicha partícula vírica un vector de virus adenoasociado recombinante que comprende al menos dos repeticiones terminales invertidas de virus 10 adenoasociados, una secuencia promotora/reguladora, una porción de intrón I de un gen del factor IX que tiene una longitud de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 1,7 kb, en la que dicha región de intrón potencia la expresión del factor IX al menos 1,5 veces, una molécula de ADN que codifica el factor IX y regiones sin traducir en 5' y 3' adjuntas y una señal de terminación de la transcripción.

2. La composición del punto 1, en la que dicha señal de terminación de la transcripción es la señal de 15 terminación de la transcripción de SV40.

3. La composición del punto 1 ó 2 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. La composición de uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en la que la molécula de ADN que codifica el factor IX tiene aproximadamente el 50% de homología con el factor IX humano.

5. Uso de la composición de uno cualquiera de los puntos 1 a 4 para la preparación de una composición 20 farmacéutica para tratar la hemofilia en un mamífero, en el que la composición está adaptada para administrarse a un tejido muscular de dicho mamífero.

6. El uso del punto 5, en el que dicho vector de virus adenoasociado recombinante se administra inyectando dicha composición a múltiples sitios en dicho tejido muscular.

7. El uso de uno cualquiera de los puntos 5 ó 6, en el que dicho vector de adenovirus recombinante se 25 administra a una dosis de entre aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 5 x 1016 genomas de vector vírico por mamífero.

8. El uso de uno cualquiera de los puntos 5, 6 y 7, en el que dicho mamífero es un ser humano.

9. El uso de uno cualquiera de los puntos 5, 6, 7 y 8 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4, en el que dicha secuencia promotora/reguladora se selecciona del grupo que está constituido por el 30 promotor/potenciador...

REIVIDICACIONES

1. Una composición que comprende una partícula vírica, comprendiendo dicha partícula vírica un vector de virus adenoasociado recombinante que comprende al menos dos repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociados, una secuencia promotora/reguladora, una porción de intrón 1 de un gen del factor IX que tiene una longitud de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 1,7 kb, en la que dicha región de intrón potencia la expresión del factor IX al menos 1,5 veces, una molécula de ADN que codifica el factor IX y regiones sin traducir en 5' y 3' adjuntas y una señal de 5 terminación de la transcripción.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha señal de terminación de la transcripción es la señal de terminación de la transcripción de SV40.

3. La composición de la reivindicación 1 ó 2 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la molécula de ADN que codifica el 10 factor IX tiene aproximadamente el 50% de homología con el factor IX humano.

5. Uso de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar la hemofilia en un mamífero en el que la composición está adaptada para administrarse a un tejido muscular de dicho mamífero.

6. El uso de la reivindicación 5, en el que dicho vector de virus adenoasociado recombinante se administra 15 inyectando dicha composición a múltiples sitios en dicho tejido muscular.

7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que dicho vector de adenovirus recombinante se administra a una dosis de entre aproximadamente 1 x 108 y aproximadamente 5 x 1016 genomas de vector vírico por mamífero.

8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 y 7, en el que dicho mamífero es un ser humano. 20

9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4, en el que dicha secuencia promotora/reguladora se selecciona del grupo que está constituido por el promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus, el promotor/potenciador del virus del sarcoma de Rous y un promotor inducible por esteroides.

10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 o la composición de una cualquiera de las 25 reivindicaciones 1 a 4 ó 9, en el que dicha porción de intrón I de un gen del factor IX tiene aproximadamente 1,4 kb.

11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 9 ó 10, en el que dicho ADN que codifica el factor IX comprende una mutación que convierte el factor IX así codificado en incapaz de unirse a colágeno IV.

12. El uso o una composición de la reivindicación 11, en el que dicha mutación en dicho ADN mutado codifica un 30 resto de alanina en lugar de lisina en la quinta posición de aminoácido desde el principio del factor IX maduro.

13. Un kit que incluye la composición descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 9 a 12 e instrucciones para usar dicho kit.