Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica un producto operativamente unido a secuencias que controlan la expresión del mismo en una célula para su uso en el tratamiento de un trastorno crónico,

en el que el producto se expresa en una célula muscular y el rAAV se purifica de adenovirus ayudantes contaminantes de modo que el producto se expresa en la célula muscular en ausencia de una respuesta inmune destructiva al producto

Uso de virus adenoasociados recombinantes en la preparación de un medicamento para la terapia génica mediante células musculares.

Este trabajo contó con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud Nº de Concesión DK47757. El Gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Antecedentes de la invención

El virus adenoasociado (AAV) es un parvovirus de replicación deficiente, cuyo genoma tiene aproximadamente 4,6 kb de longitud, incluyendo 145 repeticiones terminales invertidas de nucleótidos (ITR). El genoma de ADN monocatenario del AAV contiene genes responsables de la replicación (rep) y formación de viriones (cap).

Cuando este virus humano no patogénico infecta una célula humana, el genoma viral se integra en el cromosoma 19 lo que da como resultado la infección latente de la célula. La producción del virus infeccioso y la replicación del virus no ocurre a no ser que un virus lítico ayudante tal como adenovirus o herpesvirus coinfecte a la célula. Tras la infección con un virus ayudante, el provirus del AAV se rescata y amplifica y se producen tanto el AAV como el virus ayudante.

El AAV tiene características únicas que lo hacen atractivo como un vector para suministrar ADN extraño a las células. Distintos grupos han estudiado el uso potencial de AAV en el tratamiento de los estados de enfermedad.

Los estudios del AAV recombinante (rAAV) in vitro han sido decepcionantes debido a las bajas frecuencias de transducción; la incubación de células con rAAV en la ausencia del AAV de tipo silvestre contaminante o adenovirus ayudante contaminante se asocia con poca expresión génica recombinante [D. Russell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8915-8919 (1994); I. Alexander et al., J. Virol., 68:8282-8287 (1994); D. Russell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:5719-5723 (1995); K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1996) y F. Ferrari et al., J. Virol., 70:3227-3234 (1996)]. Además, la integración no es eficaz y no se dirige al cromosoma 19 cuando rep está ausente [S. Kumar et al., J. Mol. Biol., 222:45-57 (1991)]. La transducción de AAV se potencia sustancialmente en la presencia de adenovirus porque el genoma monocatenario de rAAV se convierte a un intermediario bicatenario no integrado que es transcripcionalmente activo [K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1996) y F. Ferrari et al., J. Virol., 70:3227-3234 (1996)]. El adenovirus aumenta la transducción del rAAV a través de la expresión del producto génico temprano E4 ORF6 [K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1996) y F. Ferrari et al., J. Virol., 70:3227-3234 (1996)].

La función de rAAV como un vector para modelos in vivo de la terapia génica ha sido mixta. Los resultados más prometedores han sido en el sistema nervioso central, donde la transducción estable se ha conseguido en células posmitóticas [M. Kaplitt et al., Nat. Genet., 8:148-154 (1994)]. La incubación de células de médula ósea ex vivo con el rAAV da como resultado algo de transducción, sin embargo no se ha demostrado un injerto hematopoyético eficaz y estable en modelos de trasplante [J. Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10183-10187(1994); G. Podsakoff et al., J. Virol., 68:5656-5666 (1994) y C. Walsh et al., J. Clin. Invest., 94:1440-1448 (1994)].

La administración de rAAV en las vías respiratorias o la sangre lleva a la transferencia génica en células epiteliales de pulmón [K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1996) y T. Flotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10613-10617 (1993)] y hepatocitos [K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1996)] respectivamente; sin embargo, se ha descubierto que la expresión transgénica es baja a no ser que el adenovirus esté presente [K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1996)].

Lo que se necesita es un método para mejorar la transferencia génica mediada por el rAAV.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un producto unido operativamente a secuencias que controlan la expresión del mismo en una célula para su uso en el tratamiento de un trastorno crónico, en el que el producto se expresa en una célula muscular y el rAAV se purifica de adenovirus ayudantes contaminantes de modo que el producto se expresa en la célula muscular en la ausencia de una respuesta inmune destructiva al producto. La invención además proporciona el uso de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un producto unido operativamente a secuencias que controlan la expresión del mismo en una célula para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno crónico, en el que el producto se expresa en una célula muscular y el rAAV se purifica de adenovirus ayudantes contaminantes de modo que el producto se expresa en la célula muscular en la ausencia de una respuesta inmune destructiva al producto. También se describe en este documento un método para mejorar la expresión de un gen seleccionado que se suministra a un animal mediante el AAV recombinante. El método implica la introducción de un vector AAV recombinante, que comprende un transgen deseado, en una célula muscular en la ausencia de un virus ayudante. El vector puede administrarse en músculo cardiaco, liso, o, preferiblemente, esquelético.

En una realización preferida, el transgen suministrado por rAAV codifica un producto secrectable y/o difundible que es terapéuticamente útil. En esta realización, el producto del transgen puede tener efecto terapéutico en sitios a una distancia del sitio de suministro. En otra realización, el transgen codifica un producto no secrectable (por ejemplo, un polipéptido de distrofina) para el que se desea el suministro al músculo (por ejemplo, para el tratamiento de la distrofia muscular).

También se describe en este documento un método para tratar un animal con hemofilia. El método implica la administración de un virus adenoasociado recombinante que comprende el gen que codifica el factor IX y secuencias que regulan la expresión del gen en el músculo del animal.

En otro aspecto más, en este documento se describe un método para tratar un animal con ateroesclerosis. El método implica la administración de un virus adenoasociado recombinante que comprende el gen que codifica la ApoE y secuencias regulatorias capaces de expresar dicho gen en el músculo del animal.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen más en la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la misma.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una ilustración esquemática que muestra la disposición lineal del AAV.CMVLacZ (4883 bp). Los elementos relevantes incluyen las ITR del AAV (cajas negras), el promotor del CMV (flecha con rayas), el intrón del SV40 y la señal de poliadelinación (cajas en blanco) y el ADN de lacZ (caja sombreada). La localización de una sonda de ADNc que se puede usar para detectar el fragmento interno de BamHI, al igual que se muestra también el vector de longitud completa.

La Fig. 2A es una ilustración esquemática de la disposición lineal del concatémero del AAV.CMVLacZ. Las marcas relevantes incluyen las ITR del AAV (cajas sombreadas), el potenciador/promotor del CMV (flecha negra), el intrón del SV40 y la señal de poliadenilación (cajas en blanco) y el ADNc de lacZ (caja sombreada). El monómero del AAV.CMVLacZ se muestra unido de acuerdo a un mecanismo de unión directo de extremo a extremo (marcado como j) en las ITR. Por lo tanto, en el dibujo están presentes dos copias de las ITR del AAV en la unión.

La Fig. 2B es una ilustración esquemática que muestra una vista amplificada del dominio de unión. Las marcas relevantes son las que se indican en la Fig. 3A anterior. Las flechas horizontales indican la localización y dirección de los cebadores de la PCR que se usan para amplificar a través de la unión del provirus. El cebador 005 es un cebador de cadena sentido. Los cebadores 013 y 017 son cebadores de cadena en antisentido.

La Fig. 3 es una ilustración esquemática que muestra el producto previsto de la PCR asumiendo una unión directa en tándem de extremo a extremo de los genomas monoméricos del AAV.CMVLacZ. Se muestran en la unión (marcada como j) dos ITR completas (caja sombreada) con sus respectivas orientaciones "FLOP"...

1. Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica un producto operativamente unido a secuencias que controlan la expresión del mismo en una célula para su uso en el tratamiento de un trastorno crónico, en el que el producto se expresa en una célula muscular y el rAAV se purifica de adenovirus ayudantes contaminantes de modo que el producto se expresa en la célula muscular en ausencia de una respuesta inmune destructiva al producto.

2. El rAAV de acuerdo con la reivindicación 1 en la que el rAAV está tan libre de contaminación con el adenovirus ayudante como puede conseguirse mediante cuatro ciclos de centrifugación en gradiente de cloruro de cesio.

3. El rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el producto se expresa en la célula muscular sin infiltración de linfocitos en el músculo.

4. El rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que se adapta para el suministro mediante administración repetida.

5. El rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico heterólogo codifica un producto terapéutico y el rAAV proporciona la expresión prolongada del producto.

6. El rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico heterólogo codifica una proteína secretable seleccionada opcionalmente del Factor IX, la apolipoproteína, el ß-interferón, la insulina, la eritropoyetina, la hormona de crecimiento y la hormona paratiroidea.

7. El rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el rAAV además comprende repeticiones terminales invertidas en 5' y en 3' del AAV flanqueando la secuencia de ácido nucleico heterólogo.

8. El rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el rAAV comprende, de 5' a 3', repeticiones terminales inversas (ITR) en 5' del AAV, un promotor heterólogo, la secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica un producto, una secuencia de poliadenilación y las ITR del AAV en 3'.

9. El rAAV de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el promotor heterólogo es un promotor constitutivo.

10. El rAAV de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el promotor constitutivo se selecciona de promotor temprano inmediato de citomegalovirus y el promotor LTR del sarcoma de Rous.

11. El rAAV de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el promotor heterólogo es un promotor inducible.

12. El rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el músculo se selecciona de un músculo esquelético, músculo cardiaco y músculo liso.

13. El rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos 10⁹ partículas de rAAV.

14. El rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende de 2,5 x 10¹⁰ a 5 x 10¹⁰ partículas de rAAV.

15. El rAAV de acuerdo con la reivindicación 14, que se inyecta en las células musculares a una dosis de 2 x 10¹¹ genomas vector de rAAV.

16. El rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el trastorno crónico es la hemofilia y el producto es el Factor IX.

17. El rAAV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el trastorno crónico es ateroesclerosis y el producto es apolipoproteina E.

18. Uso de un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una secuencia ácido nucleico heterólogo que codifica un producto unido operativamente a secuencias que controlan la expresión del mismo en una célula para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno crónico, en el que el producto se expresa en una célula muscular y el rAAV se purifica de adenovirus ayudantes contaminantes de modo que el producto se expresa en la célula muscular en la ausencia de una respuesta inmune destructiva al producto.