Una variante de polipéptido de factor VII (FVII) o factor VIIa (FVIIa) que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere en 1 a 15 residuos de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos del factor VII humano (hFVII) o factor VIIa humano (hFVIIa) mostrada en la secuencia ID SEC Nº:

01, en la que se ha introducido un residuo de aminoácido cargado negativamente mediante sustitución en la posición 36, en la que dicha variante de polipéptido en su forma activada presenta una mayor actividad de activación de FX en comparación con el factor VIIa humano recombinante

Variantes de dominio de Gla del factor VII o VIIa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes de dominio de Gla nuevas de polipéptidos de factor FVII (FVII) o Factor VIIa (FVII), así como también a tales variantes de polipéptido para uso en terapia, de forma particular para el tratamiento de una variedad de trastornos relacionados con la coagulación.

Antecedentes de la invención

La coagulación sanguínea es un procedimiento que comprende una interacción compleja de distintos componentes sanguíneos (o factores) que eventualmente resultan en una coagulación de fibrina. Por lo general, los componentes de la sangre que participan en lo que se ha denominado como la "cascada de coagulación" son proenzimas o cimógenos, es decir, proteínas enzimáticamente inactivas que se transforman en una forma activa con la acción de un activador. Uno de estos factores de coagulación es FVII.

El FVII es una proteína del plasma dependiente de la vitamina K sintetizada en el hígado y secretada en la sangre como una glicoproteína de cadena simple con un peso molecular de 53 kDa (Broze & Majerus, J. Biol. Chem. 1980; 255: 1242-1247). El cimógeno del FVII se transforma en una forma activada (FVIIa) por escisión proteolítica en un único sitio, R152-I153, dando lugar a dos cadenas unidas por un puente disulfuro simple. El FVIIa en complejo con factor de tejido (complejo de FVIIa) es capaz de transformar ambos factores IX (FIX) y factor X (FX) en sus formas activadas, seguido de reacciones que conducen a la producción rápida de trombina y formación de fibrina (diametersterud & Rapport, Proc. Natl. Acad Sci. EEUU 1977; 74; 5260-5264).

El FVII sufre modificaciones post-translacionales que incluyen carboxilación dependiente de la vitamina K que da lugar a diez residuos de ácido ?-carboxiglutámico en la región N-terminal de la molécula. Por tanto, los residuos número 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 mostrados en la ID SEC Nº 1 son residuos de ácido ?-carboxiglutámico en el dominio de Gla importantes para la actividad del FVII. Otras modificaciones post-translacionales incluyen unión del resto de azúcar a dos sitios de N-glicosilación de origen natural en la posición 145 y 322, respectivamente, y en dos sitios de O-glicosilación de origen natural en la posición 52 y 60, respectivamente.

El gen que codifica el FVII humano (hFVII) se ha mapeado en el cromosoma 13 en q34-qter 9 (de Grouchy y col., Hun Genet 1984; 66:230-233). Este contiene nueve exones y se extiende 12,8 Kb (O'Hara y col., Proc. Natl Sci EEUU 1987; 84: 5158-5162). La estructura de organización y proteína génica de FVII son similares a las de otras proteínas procoagulantes dependientes de la vitamina K, con exones 1a y 1b que codifican la secuencia de señal; exón 2 el propéptido y dominio de Gla; exón 3 una región hidrófoba corta; exones 4 y 5 los dominios tipo factor de crecimiento epidérmico; y exón 6 a 8 el dominio catalítico de la serinproteasa (Yoshitake y col., Biochemistry 1985; 24: 3736-3750).

Hay estudios relativos a estructuras tridimensionales experimentales de hFVIIa (Pike y col. Proc. Natl Acad Sci EEUU, 1999; 96:8925-30 y Kemball-Cookl y col., J. Struct. Biol., 1999; 127:213-223); de hFVIIa en complejo con factor de tejido soluble que usan procedimientos cristalográficos por rayos X (Brenner y col., Nature, 1996; 380:41 y Zhang y col., J. Mol. Biol., 1999; 285: 2089); y de fragmentos menores de hFVII (Muranyi y col., Biochemistry, 1998; 37:10605 y Kao y col., Biochemistry, 1999; 38:7097).

Se han descrito relativamente varias variantes con proteínas diseñadas de FVII (Dickinson & Ruf, J. Biol. Chem, 1997; 272:19875-19879; Kemball-Cook y col., J. Biol. Chem, 1998; 273:8516-8521; Bharadwaj y col., J. Biol Chem, 1996; 271:30685-30691; Ruf y col., Biochemistry, 1999; 38:1957-1966).

Hay estudios relativos a la expresión de FVII en BHK u otras células de mamíferos (documentos WO 92/15686, WO 91/11514 y WO 88/10295) y co-expresión de FVII y endoproteasa kex2 en células eucarióticas (documento WO 00/28065).

Se comercializan preparaciones comerciales de FVIIa humano recombinante (rhFVIIa) con el nombre comercial NovoSeven®. NovoSeven® está indicado para el tratamiento de episodios de hemorragia en pacientes con hemofilia A o B. NovoSeven® es el único rhFVIIa para tratamiento efectivo y fiable de episodios hemorrágicos actualmente disponible en el mercado.

Se ha descrito una forma inactiva de FVII en la que están modificadas arginina 152 y/o isoleucina 153 en el documento WO 91/11514. Estos aminoácidos se encuentran localizados en el sitio de activación. El documento WO 96/12800 describe la inactivación de FVIIa con un inhibidor de la serinproteinasa. Se ha descrito la inactivación por carbamilación de FVIIa en el grupo I153 de a-aminoácido por parte de Petersen y col., Eur J Biochem, 1999; 261:124-129. La forma inactivada es capaz de competir con el FVII o FVIIa de tipo salvaje por la unión al factor de tejido e inhibir la actividad coagulante. La forma inactivada de FVIIa se sugiere usar para el tratamiento de pacientes que sufren de estados hipercoagulables, tales como pacientes con sepsis o en riesgo de infarto de miocardio o apoplejía trombótica.

En relación con el tratamiento de hemorragias incontroladas tales como trauma, se cree que el FVIIa es capaz de activar FX a FXa sin unirse al factor de tejido, y se cree que esta reacción de activación ocurre principalmente en plaquetas sanguíneas activadas (Hedner y col., Blood Coagulation & Fibrinolysis, 2000; 11; 107-111). Sin embargo el hFVIIa o rhFVIIa tiene una baja actividad hacia el FX en ausencia de factor de tejido y, en consecuencia, el tratamiento de hemorragia incontrolada, por ejemplo en pacientes con trauma, requiere dosis relativamente elevadas y múltiples de hFVIIa o rhFVIIa. Por tanto con el fin de tratar hemorragias incontroladas más eficientemente (para minimizar la pérdida de sangre) hay la necesidad de moléculas de FVIIa mejoradas que posean una alta actividad hacia el FX en ausencia de factor de tejido. Tales moléculas de FVIIa mejoradas deberían mostrar un tiempo de coagulación reducido (acción más rápida/actividad de coagulación mejorada) en comparación con rhFVIIa cuando se administrar en relación con hemorragias incontroladas.

Las variantes de dominio de Gla de FVII/FVIIa se han descrito en los documentos WO 99/20767, US 6.017.882 y WO 00/66753, donde se identificaron algunos residuos localizados en el dominio de Gla como importantes para la unión de la membrana de fosfolípidos y de ahí activación de FX. De forma particular se ha encontrado que los residuos 10 y 32 eran críticos y que se podría conseguir mejor afinidad de unión de la membrana de fosfolípidos, y de ahí la mejor activación de FX, realizando las mutaciones P10Q y K32E. De forma particular se encontró que se mejoraba la activación de FX en comparación con rhFVIIa en condiciones de coagulación marginal, tales como bajo condiciones en las que está presente un bajo nivel de factor de tejido.

El documento WO 01/58935 describe una nueva estrategia para el desarrollo de moléculas de FVII o FVIIa que presenta, entre otros, una mejor vida media mediante glicosilación dirigida o PEGilación.

El documento WO 03/093465 describe variantes de FVII o FVIIa que presentan ciertas modificaciones en el dominio de Gla y presentan uno o más sitios de N-glicosilación introducidos fuera del dominio de Gla.

El documento WO 2004/029091 describe variantes de FVII o FVIIa que presentan ciertas modificaciones en el sitio de unión al factor de tejido.

Los inventores han identificado ahora residuos adicionales en el dominio de Gla que aumentan más la afinidad de unión de la membrana de fosfolípidos y de ahí que aumentan adicionalmente la activación de FX. Las variantes FVII o FVIIa de la invención pueden mostrar también afinidad de unión al factor de tejido reducida.

El objeto de la presente invención es proporcionar moléculas de FVII o FVIIa mejoradas (variantes de FVII o FVIIa) que son capaces de activar FX a FXa más eficientemente que hFVIIa, rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa. De forma particular es un objeto de la presente invención proporcionar moléculas de FVII o FVIIa mejoradas (variantes de FVII o FVIIa) que son capaces de activar FX a FXa más eficientemente que hFVIIa, rhFVIIa o [P10Q+K32E]rhFVIIa en ausencia de factor de tejido. Estos objetos están dirigidos por las variantes de...

1. Una variante de polipéptido de factor VII (FVII) o factor VIIa (FVIIa) que presenta una secuencia de aminoácidos que difiere en 1 a 15 residuos de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos del factor VII humano (hFVII) o factor VIIa humano (hFVIIa) mostrada en la secuencia ID SEC Nº: 01, en la que se ha introducido un residuo de aminoácido cargado negativamente mediante sustitución en la posición 36, en la que dicha variante de polipéptido en su forma activada presenta una mayor actividad de activación de FX en comparación con el factor VIIa humano recombinante.

2. La variante de la reivindicación 1, en la que dicha sustitución es R36D.

3. La variante de la reivindicación 1, en la que dicha sustitución es R36E.

4. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una sustitución de aminoácido en la posición 34.

5. La variante de la reivindicación 4, en la que se ha introducido un residuo de aminoácido cargado negativamente mediante sustitución en la posición 34.

6. La variante de la reivindicación 5, que comprende las sustituciones A34E+R36E.

7. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una sustitución de aminoácido en posición 10 y/o 32.

8. La variante de la reivindicación 7, que comprende la sustitución K32E.

9. La variante de la reivindicación 7, que comprende la sustitución P10Q.

10. La variante de la reivindicación 7, que comprende las sustituciones P10Q+K32E.

11. La variante de la reivindicación 10, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34E+R36E.

12. La variante de la reivindicación 10, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34L+R36E.

13. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que al menos un residuo de aminoácido que comprende un grupo de unión para un resto no polipeptídico se ha introducido en una posición localizada fuera del dominio de Gla.

14. La variante de la reivindicación 13, en la que dicho grupo de unión es un sitio de N-glicosilación introducido por sustitución.

15. La variante de la reivindicación 14, en la que dicho sitio de N-glicosilación es introducido con una sustitución seleccionada del grupo constituido por A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N, D334N y combinaciones de los mismos.

16. La variante de la reivindicación 15, que comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo constituido por T106N, I205T y V253N.

17. La variante de la reivindicación 16, que comprende dos sitios de N-glicosilación in vivo introducidos con sustituciones seleccionadas del grupo constituido por T106N+I205T, T106N+V253N e I205T+V253N.

18. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+ I205T.

19. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+ V253N.

20. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+ V253N.

21. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+ I205T.

22. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+ V253N.

23. La variante de la reivindicación 17, que comprende las sustituciones P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+ V253N.

24. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una inserción de al menos un residuo de aminoácido entre la posición 3 y 4.

25. La variante de la reivindicación 24, que comprende una inserción de un residuo de aminoácido entre la posición 3 y 4.

26. La variante de la reivindicación 25, en la que se inserta un residuo de aminoácido hidrófobo entre la posición 3 y 4.

27. La variante de la reivindicación 26, en la que dicha inserción es A3AY.

28. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+ K32E+A34E+R36E.

29. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+ K32E+A34L+R36E.

30. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+ K32E+A34E+R36E+T106N+I205T.

31. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+ K32E+A34E+R36E+T106N+V253N.

32. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+ K32E+A34E+R36E+I205T+V253N.

33. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+ K32E+A34L+R36E+T106N+I205T.

34. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+ K32E+A34E+R36E+T106N+V253N.

35. La variante de la reivindicación 27, que comprende la inserción A3AY y las sustituciones P10Q+ K32E+A34E+R36E+I105T+V253N.

36. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha variante está en su forma activada.

37. Una secuencia de nucleótidos que codifica una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36.

38. Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 37.

39. Una célula huésped que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 37 o el vector de expresión de la reivindicación 38.

40. Una composición que comprende una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

41. Una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, o una composición como se define en la reivindicación 40, para uso como un medicamento.

42. Uso de una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno en el que se desea la formación de coágulos.

43. Uso de acuerdo con la reivindicación 42, en el que dicha enfermedad o trastorno se selecciona del grupo constituido por hemorragias, incluyendo hemorragias cerebrales, hemorragias no controladas graves, tales como trauma, hemorragias en pacientes que sufren transplantes o rechazo, hemorragia variceal y hemofilia.

44. Una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno en el que la formación de coágulos es deseable.

45. Una variante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo constituido por hemorragias, incluyendo hemorragias cerebrales, hemorragias no controladas graves, tales como trauma, hemorragias en pacientes que sufren transplantes o rechazo, hemorragia variceal y hemofilia.