Un vector vírico de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de un polipéptido codificado,

dicho polipéptido comprende un péptido señal capaz de funcionar en una célula de mamífero y una neurturina bioactiva seleccionada del grupo que consiste en neurturina madura y una variante de secuencia bioactiva que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia a la neurturina truncada N-terminalmente de SEQ ID NO 9; en donde la secuencia de polinucleótido no codifica un región pro de neurturina

Vector vírico para su uso en terapia génica in vivo de la enfermedad de Parkinson.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para terapia génica, en particular a terapia génica in vivo para la distribución de neurturina bioactiva para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. En otro aspecto, la invención se refiere a construcciones víricas de expresión que comprenden un péptido señal de mamífero unido a neurturina madura o truncada N-terminalmente sin una región pro funcional entre el péptido señal y la neurturina. Estas construcciones víricas de expresión se requieren para la secreción eficaz de neurturina bioactiva en terapia génica in vivo. La invención también se refiere a células de mamífero capaces de producir neurturina en cantidades aumentadas así como el uso de estas células para la producción recombinante de neurturina bioactiva y para uso terapéutico.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo devastador que afecta a entre 1 y 1,5 millones de americanos. Cada año se diagnostican más de 35.000 casos nuevos. La incidencia de la enfermedad de Parkinson es mayor en el grupo de más de 50 años de edad, aunque se han descrito un número alarmante de casos nuevos en pacientes más jóvenes.

Las características principales de la enfermedad de Parkinson son la lentitud de movimientos (bradicinesia), un temblor o estremecimiento en las manos, brazos, piernas, mandíbula y cara, rigidez de las extremidades y el tronco, e inestabilidad postural. Según progresan estos síntomas, los pacientes pueden experimentar dificultad al andar, hablar o completar otras tareas sencillas de la vida diaria. Estas deficiencias de comportamiento están unidas a la degeneración de sistema nigroestriado en el cerebro, que es responsable de la producción de movimientos suaves, intencionados. Específicamente, las células nerviosas localizadas en la sustancia negra degeneran y hay una pérdida concomitante de dopamina que producen estas células. Las células nerviosas de la sustancia negra extienden axones o prolongaciones al cuerpo estriado, donde se secreta y utiliza la dopamina. Se ha estimado que es necesario que se produzca una pérdida del 80% de dopamina en el cuerpo estriado antes de que emerjan los síntomas de la EP.

Actualmente, levodopa (nombre comercial Sinemet) es el tratamiento principal para la enfermedad de Parkinson. En el cerebro, la levodopa se convierte en dopamina, que corrige la deficiencia en dopamina en los cerebros de los pacientes con enfermedad de Parkinson. Cuando se administra levodopa en combinación con el inhibidor periférico de la descarboxilasa, carbidopa, los pacientes de la EP experimentan beneficios drásticos. Sin embargo, el problema es que mientras que la terapia de levodopa disminuye los síntomas de la EP, no reemplaza las células nerviosas perdidas y no detiene la progresión de la enfermedad. Al progresar la EP, los pacientes requieren dosis crecientes de levodopa y pueden surgir efectos secundarios, lo más notablemente movimientos incapacitantes involuntarios y rigidez. De hecho, los especialistas en trastornos de movimiento con frecuencia retrasan el uso de levodopa e inicialmente usan otros fármacos dopaminérgicos para guardar el uso de levodopa para después en el proceso de la enfermedad cuando los pacientes más lo necesitan.

De esta manera, la levodopa tiene sus limitaciones y se necesita establecer estrategias terapéuticas adicionales para la enfermedad de Parkinson. A este respecto, se ha reavivado el interés en los tratamientos quirúrgicos para la EP. Recientemente, un procedimiento denominado estimulación cerebral profunda ha ganado considerable atención. En este procedimiento, se colocan electrodos en regiones cerebrales hiperactivas en la EP de modo que la estimulación eléctrica de estas regiones cerebrales corrige la hiperactividad. En algunos pacientes se pueden alcanzar beneficios drásticos. Otras intervenciones quirúrgicas tienen como fin mejorar la función del sistema nigroestriado. Los trasplantes de células dopaminérgicas han tenido éxito en mejorar las deficiencias motoras en modelos animales de la enfermedad de Parkinson. Los ensayos clínicos iniciales del trasplante de células dopaminérgicas en seres humanos han tenido éxito, mientras que un único ensayo clínico doble enmascarado reveló beneficios en pacientes más jóvenes, pero no en los más viejos. Sin embargo, algunos de los pacientes que recibieron injertos desarrollaron movimientos involuntarios incapacitantes. De esta manera, actualmente, los trasplantes celulares todavía se deben considerar un planteamiento experimental.

Otro planteamiento tiene como fin distribuir factores de crecimiento en el sistema nigroestriado en un intento de prevenir la degeneración de las neuronas de la sustancia negra y la pérdida concomitante del neurotransmisor dopamina.

Muchos laboratorios en todo el mundo han demostrado que el factor neurotrófico derivado de línea celular glial (GDNF) puede prevenir las consecuencias estructurales y funcionales de la degeneración del sistema nigroestriado en estudios realizados en ratas y primates. La distribución de GDNF al SNC se ha alcanzado en estudios preclínicos usando inyecciones de proteína, distribución a través de bombas y mediante terapia génica in vivo. Numerosos estudios describen la transducción de células del SNC usando AAV o lentivirus que expresan GDNF (Kordower, Ann Neurol, 2003 53 (supl 3), s120-s134; WO 03/018821, Ozawa et al; US 2002187951, Aebischer et al; Georgievska et al 2002, Exp Nerol 117(2), 461-474; Georgievska et al 2002, NeuroReport 13(1), 75-82; Wang et al., 2002, Gene Therapy, 9(6), 381-389; US 2002031493, Rohne-Poulenc Rorer SA; US 6180613 Roeckefeller University; Kozlowski et al 2000, Exp Neurol, 166(1), 1,15; Bensadoun 2000, Exp Neurol, 164(1), 15-24; Connor et al 1999, Gene Therapy, 6(12), 1936-1951; Mandel et al 1997, PNAS, 94(25), 14083-88; Lapchak et al 1997, Brain Research, 777 (1,2), 153-160; Bilang-Bleuel et al 1997, PNAS 94(16), 8818-8823).

Otros planteamientos de terapia génica in vivo para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson incluyen la transducción con virus que expresan L-aminoácido aromático descarboxilasa (AADC), ácido glutámico descarboxilasa (GAD) sutalámica (Marutso, Nippon Naika Gakkai Zasshi, 2003, 92 (8), 1461-1466; Howard, Nature Biotechnology, 2003, 21 (10), 1117-18).

Aunque GDNF parece ser un candidato prometedor para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en seres humanos, se describe que el tratamiento con GDNF produce ciertos efectos secundarios, principalmente pérdida de peso y alodinia (Hoane et al 1999, 160(1):235-43). Por tanto, existe una necesidad en la técnica para desarrollar estrategias alternativas para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en particular estrategias cuyo fin es prevenir la degeneración de las neuronas de la sustancia negra.

La neurturina es un miembro de la familia de GDNF de receptores de crecimiento y señaliza principalmente a través del receptor GFRa2. Los receptores para NTN y GDNF se expresan diferencialmente tanto espacial como temporalmente. Por tanto se debe esperar que el efecto terapéutico de NTN y GDNF sean diferentes. Esto se confirma en una comparación de GDNF y NTN distribuidos mediante minibombas osmóticas (Hoane et al 1999, 160(1):235-43). En una comparación de GDNF y NTN en un estudio de terapia génica ex vivo con degeneración de neuronas dopaminérgicas adultas inducida por 6-hidroxidopamina (el mismo modelo animal usado por los presentes inventores), los autores advirtieron que tanto GDNF como NTN prevenían la muerte de neuronas dopaminérgicas nígricas, pero sólo GDNF inducía intensidad aumentada de tinción de tirosina hidroxilasa y brotes masivos (Åkerud et al, J Neurochemistry, 73, 1:70-78).

La distribución de neurturina como formulación proteica o trasplantando células que sobreexpresan NTN al SNC en modelos de EP no ha producido resultados comparables a los resultados obtenidos con GDNF. En los estudios de tratamiento proteico, esto podría se debido a problemas con la estabilidad de las formulaciones de proteína neurturina (precipitación y semivida corta).

Hasta la fecha no hay informes sobre la terapia génica in vivo de la enfermedad de Parkinson usando neurturina. Un estudio de terapia génica usando AAV que expresa neurturina se enfocó en el tratamiento de trastornos retinianos (Jomary et al 2000, Molecular...

1. Un vector vírico de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de un polipéptido codificado, dicho polipéptido comprende un péptido señal capaz de funcionar en una célula de mamífero y una neurturina bioactiva seleccionada del grupo que consiste en neurturina madura y una variante de secuencia bioactiva que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia a la neurturina truncada N-terminalmente de SEQ ID NO 9; en donde la secuencia de polinucleótido no codifica un región pro de neurturina.

2. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal es el péptido señal de NGF.

3. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal es el péptido señal de GDNF.

4. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal es el péptido señal de persefina.

5. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal es el péptido señal de neublastina.

6. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal se selecciona del grupo que consiste en: péptido señal de NGF humano de SEQ ID NO. 40, péptido señal de NGF murino de SEQ ID NO. 41, péptido señal de GDNF humano de SEQ ID NO. 42, péptido de GDNF murino de SEQ ID NO. 43.

7. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal es un péptido señal de la inmunoglobulina (IgSP).

8. El vector según la reivindicación 6, en donde el IgSP se selecciona del grupo que consiste en IgSP murino de SEQ ID NO 4, IgSP de rata de SEQ ID NO 6, IgSP porcino de SEQ ID NO 5, IgSP de mono de SEQ ID NO 2 ó 3, IgSP humano de SEQ ID NO 1.

9. El vector de la reivindicación 8, en donde el IgSP es IgSP murino de SEQ ID NO 4.

10. El vector de la reivindicación 8, en donde el IgSP es IgSP humano de SEQ ID NO 1.

11. El vector según la reivindicación 1, el vector se selecciona del grupo que consiste en VIH, SIV, FIV, EIAV, AAV, adenovirus, retrovirus, herpesvirus.

12. El vector según la reivindicación 1, en donde el vector es una partícula de lentivirus deficiente en replicación.

13. El vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 12, en donde el promotor capaz de dirigir la expresión de dicho polipéptido se selecciona del grupo que consiste en: promotor de ubiquitina, promotor de CMV, promotor JeT, promotor de SV40, promotor del factor de elongación alfa 1 (EF1-alfa).

14. El vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 13, en donde el promotor es un promotor inducible/represible, tales como: Tet-On, Tet-Off, promotor inducible por rapamicina, Mx1.

15. El vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 14, que comprende además una secuencia potenciadora de expresión, tal como el elemento de regulación postranscripcional de virus de la hepatitis de marmota, WPRE, SP163, intrón de insulina II de rata u otros intrones, potenciador de CMV y aislador de [beta]-globina de pollo u otros aisladores.

16. El vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 15, que comprende además una secuencia que codifica para la proteína recombinasa Cre y secuencias LoxP.

17. Una composición farmacéutica que comprende el vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 16 y uno o más adyuvantes, excipientes, soportes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

18. Una célula huésped aislada diferente de una célula embrionaria humana y diferente de una célula germinal humana, dicha células huésped transducida con el vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 16.

19. La célula huésped de la reivindicación 18, que es una célula huésped de mamífero.

20. La célula huésped de la reivindicación 19, en donde dicho mamífero se selecciona del grupo que consiste en roedor (ratón, rata), conejo, pero, gato, cerdo, mono, ser humano.

21. La célula huésped de la reivindicación 19, que se selecciona del grupo que consiste en CHO, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, células neuronales, células fetales, ARPE-19, C2C12, HeLa, HepG2, células estriatales, neuronas, astrocitos, interneuronas.

22. Una línea celular empaquetadora que produce una partícula infectiva de vector que comprende la secuencia de polinucleótido como se define en la reivindicación 1, dicha partícula de vector comprende un genoma derivado de retrovirus que comprende una LTR 5' retrovírica, un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento y una LTR 3' retrovírica.

23. La línea celular empaquetadora según la reivindicación 22, en donde la partícula de vector es deficiente en replicación.

24. La línea celular empaquetadora según la reivindicación 23, en donde el genoma deriva de lentivirus y las LTR son de lentivirus.

25. Un mamífero no humano que comprende al menos una célula transducida con el vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 16.

26. El mamífero de la reivindicación 25, en donde la al menos una célula transducida comprende el genoma del mamífero.

27. Un dispositivo implantable de cultivo celular, el dispositivo comprende:

28. El dispositivo de la reivindicación 27, en donde la membrana semipermeable es inmunoaislante.

29. El dispositivo de la reivindicación 27, en donde la membrana semipermeable es microporosa.

30. El dispositivo de la reivindicación 27, en donde el dispositivo comprende además una matriz dispuesta dentro de la membrana semipermeable.

31. El dispositivo de la reivindicación 27, en donde el dispositivo es capaz de secretar más de 10 ng de neurturina biológicamente activa cada 24 horas.

32. El dispositivo de la reivindicación 27, en donde el dispositivo comprende además un anclaje atadura.

33. Una cápsula biocompatible que comprende: un núcleo que comprende células empaquetadoras vivas que secretan un vector vírico para la infección de una célula diana, en donde el vector vírico es un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16; y un recubrimiento externo que rodea dicho núcleo, dicho recubrimiento comprende un material biocompatible permeable, dicho material tiene una porosidad seleccionada para permitir el paso de vectores retrovíricos de aproximadamente 100 nm de diámetro a través del mismo, lo que permite la liberación de dicho vector vírico de dicha cápsula.

34. La cápsula de la reivindicación 33, en donde el núcleo comprende además una matriz, estando las células empaquetadoras inmovilizadas por la matriz.

35. La cápsula de la reivindicación 33, en donde el recubrimiento comprende un hidrogel o material termoplástico.

36. El vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para su uso como un medicamento.

37. Uso del vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso.

38. El uso de la reivindicación 37, en donde el trastorno del sistema nervioso es un trastorno del SNC.

39. El uso de la reivindicación 37, en donde el trastorno del SNC es una enfermedad neurodegenerativa.

40. El uso de la reivindicación 39, en donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad neurodegenerativa que implica neuronas lesionadas y traumáticas, tales como lesiones traumáticas de nervios periféricos, el bulbo, la médula espinal, daño neuronal isquémico cerebral, neuropatía, neuropatía periférica, dolor neuropático, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, deficiencia de memoria relacionado con demencia.

41. El uso de la reivindicación 39, en donde la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson.

42. El uso de la reivindicación 39, en donde la enfermedad neurodegenerativa es lesión de la médula espinal.

43. El uso de la reivindicación 39, en donde la enfermedad neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica.

44. El uso de la reivindicación 39, en donde la enfermedad es una enfermedad ocular, tal como retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma, retinopatía diabética.