Una partícula de virus quimérico que comprende:

(a)una cápsida quimérica de parvovirus,

en la que toda una región de al menos 5 aminoácidos de longitud de una subunidad de cápsida de parvovirus está sustituida por la región homóloga de una subunidad de cápsida procedente de un parvovirus diferente; y

(b)un genoma de VAA empaquetado dentro de la cápsida quimérica de parvovirus,

en la que dicha partícula de virus quimérico tiene una o más características alteradas seleccionadas entre el grupo constituido por: propiedades antigénicas; capacidades de empaquetado; tropismo celular; detección facilitada y propiedades de purificación

Vectores víricos y sus procedimientos de preparación y administración.

Declaración de financiación federal

Esta invención se llevó a cabo, en parte, con apoyo financiero del gobierno de los EEUU con las becas números DK42701 y 5-32938 0-110 del National Institutes of Health. El gobierno de los Estados Unidos tiene algunos derechos sobre esta invención.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a vectores víricos, en concreto, a vectores de parvovirus modificados y a sus procedimientos de preparación y administración.

Antecedentes

Los parvovirus son virus pequeños de ADN sin envuelta, de cadena única con entre veinte y treinta nanómetros de diámetro. Los genomas de los parvovirus tienen aproximadamente 5000 nucleótidos de longitud, que contienen dos marcos de lectura abiertos. El marco de lectura abierto a mano izquierda codifica las proteínas responsables de la replicación (Rep), mientras que el marco de lectura abierto a mano derecha codifica las proteínas estructurales de la cápsida (Cap). Todos los parvovirus tienen viriones con simetría icosaédrica compuestos por una proteína Cap mayor, normalmente la más pequeña de las proteínas Cap, y una o dos proteínas Cap menores. Las proteínas Cap se generan a partir de un gen único que inicia la traducción a partir de diferentes codones de inicio. Estas proteínas tienen términos C idénticos, pero poseen términos N únicos debido a los diferentes codones de inicio.

La mayoría de los parvovirus tienen una estrecha gama de huéspedes; el tropismo de B19 es para las células eritroides humanas (Munshi y col., (1993) J. Virology 67: 562), mientras que el parvovirus canino tiene un tropismo por los linfocitos en perros adultos (Parrish y col., (1988) Virology 166:293; Chang y col., (1992) J. Virology 66:6858). Los virus adenoasociados, por otra parte, pueden replicarse bien en líneas caninas, de ratón, pollo, bovino, mono, así como en numerosas humanas, cuando está presente el virus auxiliar apropiado. En ausencia del virus auxiliar, el VAA infectará y establecerá latencia en todos estos tipos de células, sugiriendo que el receptor de VAA es común y conservado entre especies. Se han identificado varios serotipos de VAA, que incluyen los serotipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6.

El virus adenoasociado (VAA) es un parvovirus dependiente de veinte nanómetros de tamaño que requiere la infección simultánea con otros virus (tanto adenovirus como algunos miembros del grupo del virus del herpes) para experimentar una infección productiva en células cultivadas. En ausencia de infección simultánea con el virus auxiliar, el virión de VAA se une a un receptor celular y se introduce en la célula, migrando al núcleo, y libera un genoma de ADN de cadena única que puede establecer la latencia mediante la integración en el cromosoma del huésped. El interés del VAA como vector se ha centrado alrededor de la biología de este virus. Además de su ciclo de vida único, VAA tiene una amplia gama de huéspedes para infectividad (ser humano, ratón, mono, perro, etc.), es ubicuo en seres humanos, y es completamente no patogénico. La capacidad de empaquetado finita de este virus (4,5 kb) ha restringido en el pasado el uso de este vector a genes o ADNc pequeños. Para hacer avanzar la prospección de la liberación del gen de VAA, se pueden desarrollar vectores suficientes para transportar genes más grandes. Adicionalmente, se requerirán viriones que dirijan se específica y eficientemente a tipos de células definidos sin transducir otras que serán necesarias para la aplicación clínica.

Las proteínas de la cápsida de VAA2 son Vp1, 2, y 3, con pesos moleculares de 87, 73, y 62 kDa, respectivamente. Vp3 representa casi el 80% de la proteína total en viriones intactos, mientras que Vp1 y Vp2 representan el 10% cada una (Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97; Rolling y col., (1995) Molec. Biotech. 3:9; Wistuba y col. (1997) J. Virology 71:1341). Estudios anteriores sobre el VAA2 apoyan que se necesitan las tres subunidades de la cápsida para extraer genomas de cadena única a partir de la mezcla de ADN de doble cadena replicante. A continuación se secuestran estos genomas en partículas inmaduras preformadas que maduran en partículas infecciosas. Estas partículas tienen una densidad entre 1,32 y 1,41 g/ml en cloruro de cesio y sedimentan entre 60S y 125S en sacarosa (Myers y col., (1981) (Myers y col., (1981) J. Biological Chem. 256:567; Myers y col., (1980) J. Virology 35:65).

Estudios anteriores de mutagénesis en cápsidas de AAV2 han demostrado que las inserciones y delecciones en la región Vp3 inhiben completamente la acumulación de viriones de cadena única y la producción de partículas infecciosas (Hermonat y col., (1984) J. Virology 51:329; Ruffing y col., (1992) J. Virology 66:6922). Yang y col., (1998) Human Gene Therapy 9:1929, han informado de la inserción de una secuencia que codifica la región variable de un anticuerpo de cadena única contra CD34 humano en el extremo 5' de las regiones que codifican Vp1, Vp2 o Vp3 de VAA2. Estos investigadores observaron la transducción extremadamente baja de células KG-1 que expresaban CD34 por viriones de VAA que contenían la proteína de fusión Vp2 (1,9 unidades de transducción/ml o menos, declaración que abarca las páginas 1934-35). Se dice que las células KG-1 no son permisivas a la infección por un vector de VAAr natural. Estos resultados con la Vp2 de fusión de VAA son sospechosos ya que la transducción de células KG-1 por este virus fue esencialmente insensible a un anticuerpo de cápsida dirigido contra VAA (430 frente a 310 unidades de transducción/ml; Tabla 2) mientras que la transducción de células HeLa fue marcadamente reducida por este anticuerpo (63.200 frente a < 200 unidades de transducción/ml; Tabla 2).no se emprendió la caracterización de los presuntos viriones de fusión para confirmar que las partículas contenían la proteína Vp2 de fusión, se expresaba el anticuerpo en la superficie de la cápsida, o que las partículas se unían a las proteínas CD34. Adicionalmente, se podrían producir únicamente partículas de VAAr si se proporcionaran las tres subunidades de la cápsula naturales, además de la subunidad quimérica (Página 1934, Col. 2, líneas 5-12). Colectivamente, estos resultados sugieren que las subunidades quiméricas no se incorporaron a las partículas de VAA viables, y que el bajo nivel de proteína quimérica observada en las células diana fue, de hecho, debido a la captación celular de proteína de cápsida quimérica o a que la proteína se agrega mediante otros mecanismos.

Diversos estudios han demostrados que pueden mutar las proteínas de la cápsida de parvovirus y estudiarse el ensamblaje del virión. En un estudio, se sustituyó la región de codificación de 147 aminoácidos de la lisozima de la clara de huevo de gallina por la secuencia de codificación única de Vp1 de B19. Esta modificación dio como resultado partículas vacías purificadas que retenían la actividad enzimática de la lisozima (Miyamura y col., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:8507). Adicionalmente, la expresión de los péptidos (restos 9 y 13) en Vp2 de B19 dio como resultado partículas vacías que eran inmunógenas en ratones que soportaban presentación superficial de las inserciones (Brown y col., (1994) Virology 198:477). En un estudio más reciente, se insertó nucleoproteína del virus de la coriomeningitis linfocítica (VCML) contra el epítopo CD8+CTL (restos 118-132) en la proteína Vp2 de la cápsida del parvovirus porcino (pvp) (Sedlik y col., (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94:7503). Esta proteína de cápsida, con el epítopo clonado en el término N, se autoensambló cuando se expresó en un sistema de baculovirus. Esta partícula de tipo virus quimérico se usó a continuación para inmunizar ratones contra un estímulo letal procedente de VCML. Aunque estos estudios evaluaron la estructura y el ensamblaje de la cápsida, no resolvieron el problema del empaquetado de los genomas de B19 en las cápsidas alteradas.

Los vectores de VAA(r) recombinantes requieren sólo secuencias duplicadas terminadas invertidas en cis de las 4679 bases para generar virus. El resto de secuencias víricas son dispensables y se pueden suministrar en trans (Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97). Las características atractivas de los vectores de VAA para terapia génica son la estabilidad, la simplicidad genética y la facilidad de manipulación genética de este virus. Aunque cada uno de estos factores sigue siendo válido, han salido recientemente a la luz algunos obstáculos para la aplicación de los vectores...

1. Una partícula de virus quimérico que comprende:

en la que dicha partícula de virus quimérico tiene una o más características alteradas seleccionadas entre el grupo constituido por: propiedades antigénicas; capacidades de empaquetado; tropismo celular; detección facilitada y propiedades de purificación.

2. La partícula de virus quimérico de la reivindicación 1, en la que el genoma de VAA es recombinante y comprende al menos una secuencia heteróloga de ácido nucleico empaquetada en la cápsida quimérica de parvovirus.

3. La partícula de virus quimérico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicho genoma de VAA comprende al menos un duplicado terminal invertido de VAA y opcionalmente comprende dos duplicados terminales invertidos de VAA que flanquean dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico.

4. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha toda o región de al menos 5 aminoácidos de longitud de una subunidad de cápsida de parvovirus es una región bucle de la subunidad mayor de la cápsida y está sustituida por una región bucle homóloga de la subunidad mayor de la cápsida procedente de un parvovirus diferente.

5. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que toda la subunidad de cápsida de parvovirus de dicha cápsida quimérica de parvovirus está sustituida por una subunidad de cápsida procedente de un parvovirus diferente.

6. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha cápsida de parvovirus es una cápsida de parvovirus autónoma.

7. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha cápsida de parvovirus es una cápsida de virus adenoasociado (VAA).

8. La partícula de virus quimérico de la reivindicación 7, en la que se reduce una propiedad antigénica relacionada con el serotipo de dicha cápsida VAA en comparación con la cápsida de VAA natural.

9. La partícula de virus quimérico de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en la que se altera un tropismo celular de la cápsida de VAA AA en comparación con la cápsida de VAA de tipo natural.

10. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que dicha cápsida procede de un VAA seleccionado entre el grupo constituido por los serotipos de VAA 1, 2, 3, 4, 5 y 6.

11. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la que dicha toda o región de al menos 5 aminoácidos de longitud de una subunidad de cápsida de parvovirus se sustituye por la región homóloga de una subunidad de cápsida procedente de un VAA.

12. La partícula de virus quimérico de la reivindicación 11 en la que dicha toda o región de al menos 5 aminoácidos de longitud de una subunidad de cápsida de parvovirus se sustituye por la región homóloga de una subunidad de cápsida procedente de un VAA seleccionado entre el grupo constituido por los serotipos de VAA 1, 2, 3, 4, 5 y 6; VAA aviar, VAA bovino, VAA canino, VAA equino y VAA ovino.

13. La partícula de virus quimérico de la reivindicación 12 en la que dicha cápsida de VAA es una cápsida de VAA serotipo-2.

14. La partícula de virus quimérico de la reivindicación 13 en la que dicha toda o región de al menos 5 aminoácidos de longitud de una subunidad de cápsida de parvovirus se sustituye por la región homóloga de una subunidad de cápsida procedente de un dependovirus.

15. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 en la que dicha cápsida de VAA comprende un cápsida de VAA tipo 1, 2, 3, 4, 5, o 6 en la que la región bucle 1, 2, 3 y/o 4 de la subunidad VP3 se sustituye por la región homóloga de una subunidad de cápsida procedente de un serotipo diferente de VAA.

16. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicha toda o región de al menos 5 aminoácidos de longitud de una subunidad de cápsida de parvovirus se sustituye por la región homóloga de una subunidad de cápsida procedente de un parvovirus autónomo.

17. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en la que una región bucle en la subunidad Vp3 de la cápsida mayor de VAA se sustituye por una región bucle homogénea procedente de la subunidad mayor de la cápsida de un parvovirus autónomo.

18. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, en la que dicho genoma de VAA es del mismo serotipo que dicha cápsida de VAA.

19. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que es un parvovirus híbrido.

20. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, excepto la reivindicación 19 cuando depende de la reivindicación 13, en la que dicho genoma de VAA es un genoma de VAA serotipo-2.

21. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, excepto la reivindicación 18 cuando depende de la reivindicación 13, en la que dicho genoma de VAA es un genoma de VAA serotipo-5.

22. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21, en la que dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un péptido o proteína.

23. La partícula de virus quimérico de la reivindicación 22, en la que el péptido o proteína es un péptido o proteína terapéutica o inmunogénica.

24. La partícula de virus quimérico de la reivindicación 23, en la que dicho secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un péptido o proteína terapéutico seleccionado entre el grupo constituido por proteína reguladora transmembrana de la fibrosis quística, distrofina, minidistrofina, utrofina, un factor de coagulación incluyendo Factor IX, eritropoyetina, receptor LDL, lipoproteína lipasa, ornitina transcarbamilasa, ß-globina, a-globina, espectrina, a-antitripsina, adenosina desaminasa, hipoxantina guanina fosforibosil transferasa, ß-glucocerebrosidasa, esfingomielinasa, hexosaminidasa lisosómica, ceto ácido deshidrogenasa de cadena ramificada, una hormona, un factor de crecimiento, una citocina incluyendo ß-interferón, un producto de gen suicida, y un producto génico supresor de tumores.

25. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 21, en la que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un ARN no traducido.

26. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 25, en la que la secuencia heteróloga de ácido nucleico está operativamente asociada con un elemento promotor o potenciador.

27. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en la que dicha toda o región de al menos 5 aminoácidos de longitud de una subunidad de cápsida(s) procedente de un parvovirus diferente tiene al menos aproximadamente 10, 12, 15, 20, 30, 50 ó 100 aminoácidos de longitud.

28. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en la que todos los genes cap de VAA y todos los genes rep de VAA se borran de dicho genoma de VAA.

29. La partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 en la que dicha cápsida de parvovirus comprende sustituciones en más de un emplazamiento en dicha cápsida de parvovirus.

30. Una formulación farmacéutica que comprende dicha partícula de virus quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

31. Un procedimiento in vitro para administrar una secuencia de ácido nucleico a una célula, que comprende: introducir en una célula una partícula de virus quimérico que comprende una cápsida de parvovirus y un genoma de virus adenoasociado (VAA) empaquetado en la cápsida, en el que el genoma de VAA comprende al menos un duplicado terminal invertido de VAA y al menos una secuencia heteróloga de ácido nucleico, y adicionalmente en el que toda o una región de al menos 5 aminoácidos de longitud de una subunidad de cápsida de la cápsida de parvovirus se sustituye por la región homóloga de una subunidad de cápsida procedente de un parvovirus diferente y dicha partícula de virus quimérico tiene una o más características alteradas seleccionadas entre el grupo constituido por: propiedades antigénicas; capacidades de empaquetado; tropismo celular; detección facilitada u propiedades de purificación.

32. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que la al menos un secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica una proteína o péptido.

33. El procedimiento de la reivindicación 31 ó 32, en el que la célula se selecciona entre el grupo constituido por una célula neural, una célula de pulmón, una célula retinal, una célula epitelial, una célula muscular, una célula pancreática, una célula hepática, una célula de miocardio, una célula de hueso, una célula de bazo, heratinocito, fibroblasto, célula endotelial, célula de próstata, célula germinal, célula progenitora, y una célula troncal.

34. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que la cápsida de parvovirus es una cápsida de VAA.

35. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, en la que dicho genoma de VAA es un genoma de VAA serotipo-2.

36. Un procedimiento in vitro para producir una partícula de virus quimérico que comprende:

37. El procedimiento de la reivindicación 36 en el que el parvovirus es un VAA.

38. El procedimiento de la reivindicación 36 ó 37, en el que el genoma de VAA recombinante codifica al menos un duplicado terminal invertido de VAA que flanquea dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico y opcionalmente codifica dos duplicados terminales invertidos de VAA que flanquean dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico.

39. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, en la que dichos genes cap y rep se

40. El procedimiento de la reivindicación 39, en el que el vector es un vector plásmido o vírico.

41. La partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 para uso como medicamento, en la que el genoma de VAA es recombinante y comprende al menos un secuencia heteróloga de ácido nucleico empaquetada en la cápsida quimérica de parvovirus y adicionalmente en la que dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica una proteína o péptido terapéutico o inmunogénico.

42. La partícula de virus quimérico según la reivindicación 41 para uso como composición de vacuna.

43. El uso de una partícula de virus quimérico según la reivindicación 24 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del siguiente grupo: fibrosis quística; hemofilia A; hemofilia B; talasemia; diabetes mellitus; distrofia muscular de Becker; distrofia muscular de Duchenne; enfermedad de Gaucher; enfermedad de Hurler; deficiencia en adenosina desaminasa; y enfermedades de almacenamiento del glicógeno.

44. El uso de una partícula de virus quimérico según la reivindicación 24, en la que dicho ácido nucleico heterólogo codifica la proteína reguladora transmembrana de la fibrosis quística para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la fibrosis quística.

45. El uso de una partícula de virus quimérico según la reivindicación 24, en la que dicho ácido nucleico heterólogo codifica el Factor IX para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hemofilia B.

46. El uso de una partícula de virus quimérico según la reivindicación 24, en la que dicho ácido nucleico heterólogo codifica la ß-globina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de talasemia.

47. El uso de una partícula de virus quimérico según la reivindicación 24, en la que dicho ácido nucleico heterólogo codifica la adenosina desaminasa para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la deficiencia en adenosina desaminasa.

48. El uso de una partícula de virus quimérico según la reivindicación 24, en la que dicho ácido nucleico heterólogo codifica la ß-glucocerebrosidasa para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher.

49. El uso de una partícula de virus quimérico según la reivindicación 24, en la que dicho ácido nucleico heterólogo codifica distrofina o una minidistrofina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker.