UN METODO PARA EXPRESAR UN PRODUCTO GENICO EN EL TEJIDO MUSCULAR DE UN ANIMAL,

QUE COMPRENDE LA ADMINISTRACION DE UN VECTOR AAV RECOMBINANTE AL TEJIDO MUSCULAR DEL ANIMAL, EN EL QUE EL VECTOR COMPRENDE UN GEN DE INTERES NO DE AAV LIGADO EN UN GENOMA DE VECTOR AAV

Transducción de mioblastos por VAA.

Campo técnico

Esta invención está en el campo de la expresión génica y se dirige especialmente a la expresión de productos génicos en el músculo de un animal.

Antecedentes

Los vectores de virus adenoasociados (VAA) se han propuesto y patentado como vectores para la expresión de productos génicos en animales. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.193.941, publicada el 18 de agosto de 1992, los documentos WO 9413788 y 08/227.319, la última solicitud procedente del laboratorio de los presentes inventores. En varias patentes y otras publicaciones se describen numerosos vectores VAA y sus usos, estando los usos generalmente relacionados con la expresión de productos génicos in vitro (normalmente en cultivos tisulares) o in vivo (normalmente en pulmones o mucosa nasal, los sitios normales de infección de VAA, aunque la solicitud de EE.UU. Nº de serie 08/227.319 se refiere a la expresión en el sistema nervioso central).

Las investigaciones realizadas en los laboratorios de los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que los vectores de VAA pueden actuar como sistemas eficaces de expresión a largo plazo en el tejido muscular de animales después de una inyección intramuscular. Este descubrimiento proporciona un nuevo procedimiento de expresión de productos génicos deseables y de elementos de control en el tejido muscular de animales, incluido humanos.

Resumen de la invención

En consecuencia, es un objeto de la invención proporcionar nuevos usos para los vectores de VAA que ya han sido desarrollados para otros fines.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar nuevos vectores recombinantes de VAA que contengan sistemas de expresión génica dirigidos al tejido muscular.

Estos y otros objetos de la invención se han logrado proporcionando un procedimiento de expresión de un producto génico en el tejido muscular de un animal, lo que comprende la administración de un vector de VAA recombinante al tejido muscular del animal, en el que el vector comprende un gen de interés que no es de VAA ligado a un vector de VAA.

Descripción de las realizaciones específicas

La presente invención es bastante sencilla: antes de esta invención, los vectores de VAA recombinantes se conocían bien y se sabía que eran capaces de transducirse en diversas células y tejidos, pero no se habían usado, ni se sugirió su uso, en la expresión de productos génicos en el tejido muscular de animales. La invención además comprende administrar al tejido muscular de un animal objetivo un vector recombinante de VAA que contiene un gen cuya expresión es deseable (junto con los elementos de control apropiados, si se desea o es necesario de forma normal para los vectores). No es necesario ningún vector nuevo puesto que se ha demostrado que los vectores de VAA previamente conocidos funcionan bien para la expresión en tejido muscular. De este modo, la invención es en parte un descubrimiento que no requiere ninguna adaptación en especial de los vectores de VAA para la expresión en tejido muscular, lo que es sorprendente en vista de los estrictos requisitos de reproducción de los VAA (es decir, la presencia de un virus auxiliar) y la normal asociación de los VAA con pulmones y fosas nasales.

En diversas publicaciones científicas y patentes se describe el estado de la técnica en el campo de los vectores de VAA. Puesto que no se requiere ninguna adaptación especial de los vectores de la técnica previa para la práctica de la presente invención, no hay necesidad de detallar aquí en extensión el estado de la técnica ya bien conocida. Sin embargo, las siguientes publicaciones se incorporan en este documento por referencia, como lo son la patente y las solicitudes de patente (y sus equivalentes publicadas) identificadas en la sección de Introducción de esta descripción, ya que estos materiales pueden ser útiles para aquellos con menos experiencia en el campo de los VAA:

1. Samulski, R.J. y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79:2077-2081 "Cloning of Adeno-Associated Virus into pBR322: Rescue of Intact Virus from Recombinant Plasmid in Human Cells"

2. Samulski, R.J. y col. (1983) Cell 33:l35-143 "Rescue of Adeno-Associated Virus from Recombinant Plasmids: Gene Correction within the Terminal Repeats of AAV"

3. Laughlin y col. (1983) Gene 23:65-73 "Cloning of Infectious Adeno-Associated Virus Genomes in Bacterial Plasmids"

4. Hermanot, P.L. y Muzycka, N. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:6466-6470 "Use of Adeno-Associated Virus as a Mammalian DNA Cloning Vector: Transduction of Neomycin Resistance into Mammalian Tissue Culture Cells"

5. Senepathy, P. y col. (1984) J. Mol. Biol. 178, 179:1-20 "Replication of Adeno-Associated Virus DNA Complementation of Naturally Occurring rep^- Mutants by a Wild-type Genome or an ori^- Mutant and Correction of Terminal Palindrome Deletions"

6. Tratschin y col. (1984) J. Virol. 51:611-619 "Genetic Analysis of Adeno-Associated Virus: Properties of Deletion Mutants Constructed In Vitro and Evidence for an Adeno-Associated Virus Replication Function"

7. Tratschin y col. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 "A Human Parvovirus, Adeno-Associated Virus, as a Eukaryotic Vector: Transient Expression and Encapsidation of the Prokaryotic Gene for Chloramphenicol Acetyltransferase"

8. Miller y col. (1986) Somatic Cell and Molecular Genetics 12:175-183 "Factors Involved in Production of Helper Virus-Free Retrovirus Vectors"

9. Bosselman y col. (1987) Mol. Cell. Biol. 7:1797-1806 "Replication-Defective Chimeric Helper Proviruses and Factors Affecting Generation of Competent Virus: Expression of Moloney Murine Leukemia Virus Structural Genes via the Metallothionein Promoter"

10. Ohi y col. (1988) J. Cell. Biol. 107:304A "Construction and Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus Genome Containing ß-globin cDNA"

11. McLaughlin y col. (1988) J. Virol. 62:1963-1973 "Adeno-Associated General Transduction Vectors: Analysis of Proviral Structures"

12. Lebkowski y col. (1988) Mol. Cell Biol. 8:3988-3996 "Adeno-Associated Virus: a Vector System for Efficient Introduction and Integration of DNA into a Variety of Mammalian Cell Types"

13. Samulski y col. (1989) J. Virol. 63:3822-3828 "Helper-Free Stocks of Recombinant Adeno-Associated Viruses: Normal Integration Does not Require Viral Gene Expression"

14. Srivastava y col. (Octubre 1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:20, 8078-82 "Construction of a recombinant human parvo virus-B19: adeno-associated virus-2 (AAV) DNA inverted terminal repeats are functional is an AAV-B19 hybrid virus -vector construction; potential application gene cloning in bone marrow cell culture and gene therapy"

15. Ohi, S. y col. (1990) J. Cell.Biochem. (Supl.14A,D422) "Construction of recombinant adeno-associated virus that harbors human beta-globin cDNA - vector construction for potential application in hemoglobinopathy gene therapy; gene cloning and expression in 293 cell culture"

16. Ohi, S. y col. (1990) Gene 89 2:279-82 "Construction and replication of an adeno-associated virus expression vector that contains human beta-globin cDNA - plasmid PAVh-beta-GHP11 and plasmid PAVh-beta-G-psi-1 construction; potential application in gene therapy of e.g. sickle cell anemia or thalassemia"

17. Ohi, S. y col. (1990) FASEB J. 4:7, A2288) "Production and expression of recombinant adeno-associated viruses harboring human beta-globin cDNA - adeno-associated virus expression in 293 cell culture; potential gene therapy for hemoglobinopathy disease"

18. Samulski y col. (1991) Embo J. 10:3941-3950 "Targeted Integration of Adeno-associated virus AAV Into human chromosome 19"

19. Ruffing y col. (Dic. 1992) J. Virol. 66:6922-6930 "Assembly of Viruslike Particles by Recombinant Structural Proteins of Adeno-Associated Virus Type 2 in Insect Cells"

20. Sitaric...

1. Uso de un vector recombinante de VAA que comprende un gen que no es de VAA capaz de expresar un producto génico, ligado en un vector de VAA, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad causada por una deficiencia de dicho producto génico, que requiere ser producido y/o secretado en un animal, en el que la composición se administra en el tejido muscular de un animal.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicha composición que comprende dicho vector se administra disuelta o resuspendida en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable.

3. El uso de la reivindicación 2, en el que dicho vehículo líquido comprende una solución acuosa.

4. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho gen comprende un segmento de ADN que codifica una proteína ligado de forma operativa a un promotor operativo en dicho tejido muscular.

5. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicha administración es mediante inyección intramuscular.

6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha administración es mediante transporte transdérmico.

7. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho vector de VAA comprende ADN que no es de VAA, ligado a un genoma de VAA en lugar o además de una secuencia de ADN del VAA que excluye los primeros y últimos 145 pares de bases de dicho genoma de VAA o ADN que no es de VAA operativamente ligado a un vector que comprende un segmento genómico D doble de VAA que consiste en 165 pares de bases incluyendo una repetición terminal interna con segmentos D en ambos extremos.

8. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho gen comprende un segmento de ADN que es capaz de transcribirse para producir una molécula de ARN que codifica una proteína y que tienen señales de iniciación y parada de la traducción para dicha proteína.

9. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho animal es un ave o un mamífero.

10. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho animal es un humano.

11. El uso de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho gen de interés que no es de VAA codifica, ß-galactosidasa.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la enfermedad es una coagulopatía como la hemofilia, una enfermedad endocrina como la diabetes o una enfermedad metabólica como la enfermedad de Gaucher.