Un procedimiento de caracterización estructural de una proteína policlonal recombinante o una línea celular policlonal.

Un procedimiento para caracterizar una muestra que comprende un anticuerpo policlonal recombinante que comprende anticuerpos individuales que tienen diferentes regiones variables,

en el que dicha muestra se deriva de un sobrenadante de cultivo celular de un cultivo celular policlonal que produce dicho anticuerpo policlonal recombinante, en el que el cultivo celular policlonal comprende clones individuales que expresan cada uno un miembro individual diferente del anticuerpo policlonal recombinante, tal información se obtiene en lo que respecta a la proporción relativa o presencia de miembros de anticupero individual de dicha muestra, comprendiendo el procedimiento analizar alícuotas de dicha muestra mediante al menos una técnica de caracterización de proteína seleccionada de análisis cromatográfico que separa proteína de acuerdo con una propiedad físico-química distinta del tamaño.

Un procedimiento de caracterización estructural de una proteína policlonal recombinante o una línea celular policlonal Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para la caracterización de un anticuerpo policlonal recombinante.

Antecedentes de la invención Está admitido desde hace mucho tiempo que la administración profiláctica o terapéutica de anticuerpos (denominada como inmunización pasiva) puede potenciar la capacidad del sistema inmune del cuerpo para eliminar agentes infecciosos. Dichos anticuerpos terapéuticos se han obtenido históricamente del plasma humano (por lo cual, la composición de anticuerpos se denomina inmunoglobulina o gammaglobulina) . Para obtener estos anticuerpos, se recogen combinaciones de sangre procedentes de donantes humanos inmunes y se extrae y se purifica la fracciónde inmunoglobulina. Únicamente una fracción de la inmunoglobulina será específica de un antígeno concreto. El uso terapéutico de la inmunoglobulina es complicado debido a diversas limitaciones tales como un número limitado de donantes, fabricación cara, riesgo de contaminantes infecciosos procedentes de los donantes, variaciones lote a lote inevitables así como regímenes de administración complicados.

Los anticuerpos monoclonales recombinantes han proporcionado recientemente una alternativa a los productos de inmunoglobulina. Se dirigen, sin embargo, únicamente, contra una diana única y pueden por tanto no ser eficaces contra dianas que son complejas o dinámicas, tales como los agentes infecciosos. Existen algunos ejemplos de anticuerpos monoclonales mixtos con el fin de superar este problema (por ejemplo, Nowakowski, A. y col. 2002. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 99, 11346-11350 y documento US 5.126.130) .

Recientemente, se ha desarrollado una tecnología para la producción recombinante de anticuerpos policlonales muy específicos adecuados para la administración profiláctica y terapéutica (documento WO 2004/061104) . Se puede purificar el anticuerpo policlonal recombinante (rpAb) procedente de un biorreactor de producción en forma de una preparación única sin manipulación, fabricación, purificación, o caracterización separadas de los miembros individuales que constituyen la proteína policlonal recombinante. Sin embargo, dicha estrategia de producción requiere un procedimiento para verificar la identidad y demostrar la producción consistente en el tiempo de la mezcla compleja de moléculas de anticuerpo.

Además, un anticuerpo policlonal producido industrialmente usando la tecnología recombinante tendrá que caracterizarse hasta un cierto grado para obtener la aprobación de los organismos reguladores nacionales y supranacionales como fármaco de investigación o terapéutico. Debido a que el planteamiento de un anticuerpo policlonal recombinante es un concepto completamente nuevo, el problema de caracterizar una muestra que comprende múltiples proteínas diferentes pero muy homólogas con respecto a la proporción relativa de proteínas individuales en la muestra no se había abordado nunca anteriormente. De esta manera, la inmunoglobulina derivada de sangre se aprobó en general basándose en los datos de eficacia clínica y no clínica y a menudo en los datos de seguridad histórica, así como en la química bruta, la fabricación y los parámetros de control (CMC) tales como pureza, título de la unión, y ausencia de agentes adicionales. Dicha solución simplista es por supuesto no aceptable para las proteínas producidas de manera recombinante. Por tanto, para las mezclas de unos pocos anticuerpos monoclonales, las directrices reguladoras establecen que dichas mezclas deberían someterse a la caracterización individual de cada anticuerpo constituyente de la mezcla usando las técnicas de caracterización química integral de las proteínas acopladas con ensayos biológicos. Sin embargo, no existe solución técnicamente factible o apropiada para una composición genuinamente policlonal, basada en más de 10, 20 o incluso más anticuerpos diferentes.

El documento WO 2004/009618 describe la producción de mezclas de anticuerpos de un clon celular simple, donde el clon simple comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera común y al menos dos cadenas pesadas diferentes, con lo que resulta la producción de una mezcla de anticuerpos de las células huésped.

Los documentos US 5.789.209 y US 6.335.163 desvelan procedimientos para la creación de bibliotecas de anticuerpos policlonales, por ejemplo, bibliotecas específicas del paciente o específicas del antígeno para tratamiento o diagnóstico de trastornos neoplásticos, donde las bibliotecas o sub-bibliotecas se pueden transferir desde un vector de expresión a otro sin pérdida significativa de diversidad de biblioteca.

Chen y col. (Immunology Letters (2003) vol. 88: nº 2, páginas 135-140) describen la transferencia de masa de pares de genes de región VL-VH de una biblioteca que muestra un fago Fab de cáncer anti-colorectal para un vector de expresión de mamífero y la producción de una biblioteca prototipo de anticuerpos IgG policlonal de células Sp2/0 transfectadas con la biblioteca de vector de expresión de mamífero.

Toto y col (J. of Interferon and Cytokine Res. (2001) vol. 21, nº 11, páginas 813-920) describen un procedimiento de purificación usado para obtener un producto de interferona-a humana (IFN-a) que contiene la subtipos de IFN-a principales producidos por leucocitos humanos, y caracterización del producto por wetern blotting y RP-HPLC.

El documento 2004/061104 describe un procedimiento para la fabricación de una composición de proteína policlonal recombinante, usando integración dirigida al sitio basada en recombinasa de las secuencias que codifican proteína en el genoma de células huésped para dar una colección de células adecuadas para uso como una línea celular de fabricación de proteína policlonal recombinante.

Mhatre y col (J. Chromatography (1995) vol 707, nº 2, páginas 225-231) describen la purificación de fragmentos de anticuerpo Fab mediante cromatografía de intercambio catiónico y elución en gradiente de pH.

Divulgación de la contribución La presente invención proporciona una plataforma de caracterización estructural para demostrar la producción consistente de una mezcla de diferentes proteínas homólogas, tal como una proteína policlonal recombinante, en particular un anticuerpo policlonal recombinante, procedente de una línea celular policlonal.

Descripción de la invención Un prerrequisito para la producción industrial de una proteína policlonal recombinante para uso profiláctico y terapéutico es el mantenimiento de la diversidad clonal durante la expresión. Por tanto, es importante ser capaz de seguir y medir la diversidad clonal de una línea celular policlonal que produce un anticuerpo policlonal, así como la representación relativa de las proteínas individuales en la proteína policlonal en cualquier momento deseado, y en cualquier muestra relevante, permitiendo de esta manera el análisis de la estabilidad del sistema de expresión en un lote único, así como la variación lote a lote del producto final.

Las composiciones de proteínas homólogas tales como un anticuerpo policlonal recombinante o un receptor de linfocito T policlonal recombinante (TcR) están comprendidas por proteínas variables con propiedades físicoquímicas muy similares. Esto es una ventaja cuando se purifica una proteína policlonal producida de manera recombinante, debido a que la purificación se puede llevar a cabo como si se tratara de una proteína única, sin pérdida de diversidad durante el procedimiento. Esta similitud, sin embargo, representa un desafío cuando se caracteriza la distribución relativa de los miembros individuales de una proteína policlonal, debido a que la similitud en las propiedades físico-químicas hace difícil distinguir un miembro individual de otro.

Más comúnmente, cuando se produce una proteína policlonal recombinante, se conoce la composición original, debido a que las secuencias que codifican la proteína policlonal se han aislado, rastreado y secuenciado antes de la generación de una línea celular de fabricación policlonal para la producción de proteína policlonal recombinante. Para la generación de dicha línea celular, véase por favor el documento WO 2004/061104. Una rara excepción a lo anterior puede ser situaciones en las que una biblioteca no rastreada o no seleccionada, por ejemplo, de un paciente convaleciente, se usa directamente para generar un anticuerpo policlonal recombinante.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para caracterizar una muestra que comprende un anticuerpo policlonal recombinante que comprende anticuerpos individuales que tienen diferentes regiones variables, en el que dicha muestra se deriva de un sobrenadante de cultivo celular de un cultivo celular policlonal que produce dicho anticuerpo policlonal recombinante, en el que el cultivo celular policlonal comprende clones individuales que expresan cada uno un miembro individual diferente del anticuerpo policlonal recombinante, tal información se obtiene en lo que respecta a la proporción relativa o presencia de miembros de anticupero individual de dicha muestra, comprendiendo el procedimiento analizar alícuotas de dicha muestra mediante al menos una técnica de caracterización de proteína seleccionada de análisis cromatográfico que separa proteína de acuerdo con una propiedad físico-química distinta del tamaño.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos un análisis cromatográfico individual basado en las propiedades fisicoquímicas seleccionadas entre i) carga neta, ii) hidrofobicidad, iii) punto isoeléctrico y iv) afinidad.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, que comprende además al menos una técnica de caracterización de proteína seleccionada de i) análisis de digestiones proteolíticas de anticuerpos individuales, ii) secuenciación del terminal N "en masa" e iii) análisis usando moléculas de detector específico de los anticuerpos individuales.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho análisis cromatográfico se lleva a cabo como una cromatografía multidimensional.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el análisis de las digestiones proteolíticas de los anticuerpos individuales lleva a cabo con el fin de aislar péptidos marcadores N terminales o péptidos con funcionalidad característica de cadena lateral de aminoácidos.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dichas moléculas detectoras específicas son péptidos anti-idiotipos o anticuerpos anti-idiotipos.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho péptido anti-idiotipo o anticuerpo anti-idiotipo se utiliza en la determinación de las células que producen proteínas individuales en una línea celular policlonal.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha caracterización se basa en el análisis de una o más proteínas centinela presentes en dicha muestra.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se aplican al menos dos técnicas analíticas para analizar dicha muestra.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que una técnica analítica es una técnica de caracterización de proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y la otra técnica analítica es un análisis genético de las secuencias de codificación de proteína de las células de dicho cultivo.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho análisis genético se seleccionada de RFLP, T-RFLP, análisis por micromatriz, PCR cuantitativa y secuenciación de ácido nucleico.

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que (a) se obtienen muestras de un cultivo celular policlonal simple en diferentes momentos durante el cultivo, y se comparan las proporciones relativas de dichos anticuerpos individuales de sus secuencias de codificación, o

(b) se obtienen muestras de diferentes cultivos de células policlonales en un determinado momento, y se comparan las proporciones relativas de dichos anticuerpos individuales y de forma opcional de sus secuencias de codificación.

13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo dicho procedimiento un análisis cromatográfico basado en la carga neta, en el que las proteínas recombinantes que presentan heterogeneidad de carga producida por ciclación de restos de glutamina N terminales se someten a un procedimiento en el que se elimina la heterogeneidad de carga N terminal mediante cambio de dichos residuos de glutamina N terminal por otro aminoácido.