UN PROCEDIMIENTO PARA LA CARACTERIZACION DE UNA LINEA CELULAR POLICLONAL.

Un procedimiento para caracterizar una muestra de una línea celular policlonal que comprende células que producen diferentes proteínas homólogas conocidas que tienen diferentes regiones variables,

de tal manera que se obtiene información con respecto a la proporción o presencia relativa de las secuencias que codifican proteínas de dichos miembros de la proteína homóloga individual de dicha muestra, en el que dicha línea celular policlonal es una fracción de cultivo celular que comprende las células de dicho cultivo, comprendiendo dicho procedimiento analizar alícuotas de dicha muestra de línea celular policlonal mediante uno o más análisis genéticos de las secuencias que codifican proteínas, en el que dicho uno o más análisis genéticos se llevan a cabo en alícuotas que comprenden una población mixta de células sin aislamiento de las células individuales

Un procedimiento para la caracterización de una línea celular policlonal.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la caracterización estructural de una proteína policlonal recombinante o una línea celular policlonal que produce dicha proteína, con el fin de verificar la consistencia lote a lote de los productos finales así como la estabilidad composicional durante la producción de un lote. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para caracterizar un anticuerpo policlonal recombinante.

Antecedentes de la invención

Está admitido desde hace mucho tiempo que la administración profiláctica o terapéutica de anticuerpos (denominada como inmunización pasiva) puede potenciar la capacidad del sistema inmune del cuerpo para eliminar agentes infecciosos. Dichos anticuerpos terapéuticos se han obtenido históricamente del plasma humano (por lo cual, la composición de anticuerpos se denomina inmunoglobulina o gammaglobulina). Para obtener estos anticuerpos, se recogen combinaciones de sangre procedentes de donantes humanos inmunes y se extrae y se purifica la fracción de inmunoglobulina. Únicamente una fracción de la inmunoglobulina será específica de un antígeno concreto. El uso terapéutico de la inmunoglobulina es complicado debido a diversas limitaciones tales como un número limitado de donantes, fabricación cara, riesgo de contaminantes infecciosos procedentes de los donantes, variaciones lote a lote inevitables así como regímenes de administración complicados.

Los anticuerpos monoclonales recombinantes han proporcionado recientemente una alternativa a los productos de inmunoglobulina. Se dirigen, sin embargo, únicamente, contra una diana única y pueden por tanto no ser eficaces contra dianas que son complejas o dinámicas, tales como los agentes infecciosos. Existen algunos ejemplos de anticuerpos monoclonales mixtos con el fin de superar este problema (por ejemplo, Nowakowski, A. y col. 2002. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 99, 11346-11350 y documento US 5.126.130).

Recientemente, se ha desarrollado una tecnología para la producción recombinante de anticuerpos policlonales muy específicos adecuados para la administración profiláctica y terapéutica (documento WO 2004/061104). Se puede purificar el anticuerpo policlonal recombinante (rpAb) procedente de un biorreactor de producción en forma de una preparación única sin manipulación, fabricación, purificación, o caracterización separadas de los miembros individuales que constituyen la proteína policlonal recombinante. Sin embargo, dicha estrategia de producción requiere un procedimiento para verificar la identidad y demostrar la producción consistente en el tiempo de la mezcla compleja de moléculas de anticuerpo.

Además, un anticuerpo policlonal producido industrialmente usando la tecnología recombinante tendrá que caracterizarse hasta un cierto grado para obtener la aprobación de los organismos reguladores nacionales y supranacionales como fármaco de investigación o terapéutico. Debido a que el planteamiento de un anticuerpo policlonal recombinante es un concepto completamente nuevo, el problema de caracterizar una muestra que comprende múltiples proteínas diferentes pero muy homólogas con respecto a la proporción relativa de proteínas individuales en la muestra no se había abordado nunca anteriormente. De esta manera, la inmunoglobulina derivada de sangre se aprobó en general basándose en los datos de eficacia clínica y no clínica y a menudo en los datos de seguridad histórica, así como en la química bruta, la fabricación y los parámetros de control (CMC) tales como pureza, título de la unión, y ausencia de agentes adicionales. Dicha solución simplista es por supuesto no aceptable para las proteínas producidas de manera recombinante. Por tanto, para las mezclas de unos pocos anticuerpos monoclonales, las directrices reguladoras establecen que dichas mezclas deberían someterse a la caracterización individual de cada anticuerpo constituyente de la mezcla usando las técnicas de caracterización química integral de las proteínas acopladas con ensayos biológicos. Sin embargo, no existe solución técnicamente factible o apropiada para una composición genuinamente policlonal, basada en más de 10, 20 o incluso más anticuerpos diferentes.

El documento US 6.335.163 B1 desvela procedimientos para la creación de bibliotecas de anticuerpos policlonales. Los Ejemplos 12 y 14 describen procedimientos para evaluar la complejidad de dichas bibliotecas. El Ejemplo 12 describe el plaqueado de una biblioteca que muestra el fago Fab y el repicado de la colonias individuales para la secuenciación de los nucleótidos de la región V, así como los ensayos de unión por competición de los fragmentos Fab procedentes de clones diferentes usando ELISA. El Ejemplo 14 describe la evaluación de la complejidad de una biblioteca de expresión que contiene al menos aproximadamente 25.000 combinaciones diferentes de VH-VL determinando las secuencias de nucleótidos de 30-40 combinaciones individuales de VH-VL.

Chen y col. (Immunology Letters (2003) 88: 135-140) describen la expresión de una biblioteca de anticuerpos policlonales de cáncer anti-colorrectal prototípico en células de mamíferos, incluyendo el análisis y la secuenciación de los nucleótidos procedentes de clones individuales.

Descripción de la contribución

La presente invención proporciona una plataforma de caracterización estructural para demostrar la producción consistente de una mezcla de diferentes proteínas homólogas, tal como una proteína policlonal recombinante, en particular un anticuerpo policlonal recombinante, procedente de una línea celular policlonal.

Descripción de la invención

Un prerrequisito para la producción industrial de una proteína policlonal recombinante para uso profiláctico y terapéutico es el mantenimiento de la diversidad clonal durante la expresión. Por tanto, es importante ser capaz de seguir y medir la diversidad clonal de una línea celular policlonal que produce un anticuerpo policlonal, así como la representación relativa de las proteínas individuales en la proteína policlonal en cualquier momento deseado, y en cualquier muestra relevante, permitiendo de esta manera el análisis de la estabilidad del sistema de expresión en un lote único, así como la variación lote a lote del producto final.

Las composiciones de proteínas homólogas tales como un anticuerpo policlonal recombinante o un receptor de linfocito T policlonal recombinante (TcR) están comprendidas por proteínas variables con propiedades físico-químicas muy similares. Esto es una ventaja cuando se purifica una proteína policlonal producida de manera recombinante, debido a que la purificación se puede llevar a cabo como si se tratara de una proteína única, sin pérdida de diversidad durante el procedimiento. Esta similitud, sin embargo, representa un desafío cuando se caracteriza la distribución relativa de los miembros individuales de una proteína policlonal, debido a que la similitud en las propiedades físico-químicas hace difícil distinguir un miembro individual de otro.

Más comúnmente, cuando se produce una proteína policlonal recombinante, se conoce la composición original, debido a que las secuencias que codifican la proteína policlonal se han aislado, rastreado y secuenciado antes de la generación de una línea celular de fabricación policlonal para la producción de proteína policlonal recombinante. Para la generación de dicha línea celular, véase por favor el documento WO 2004/061104. Una rara excepción a lo anterior puede ser situaciones en las que una biblioteca no rastreada o no seleccionada, por ejemplo, de un paciente convaleciente, se usa directamente para generar un anticuerpo policlonal recombinante.

Para asegurar que la diversidad de la salida (la proteína policlonal recombinante) se asemeje a la diversidad de la entrada (la biblioteca de secuencias de codificación) tras el cultivo y la purificación, será necesario obtener información con respecto a la proporción relativa de miembros individuales de la proteína policlonal y/o sus secuencias de codificación dentro de la línea celular de fabricación policlonal. La presente invención proporciona una plataforma de caracterización estructural, basada en el análisis genético así como técnicas de caracterización de proteínas, capaces de proporcionar información con respecto a la diversidad de una línea celular policlonal y una proteína policlonal.

Definiciones

El término "anticuerpo anti-idiotipo" se refiere...

1. Un procedimiento para caracterizar una muestra de una línea celular policlonal que comprende células que producen diferentes proteínas homólogas conocidas que tienen diferentes regiones variables, de tal manera que se obtiene información con respecto a la proporción o presencia relativa de las secuencias que codifican proteínas de dichos miembros de la proteína homóloga individual de dicha muestra, en el que dicha línea celular policlonal es una fracción de cultivo celular que comprende las células de dicho cultivo, comprendiendo dicho procedimiento analizar alícuotas de dicha muestra de línea celular policlonal mediante uno o más análisis genéticos de las secuencias que codifican proteínas, en el que dicho uno o más análisis genéticos se llevan a cabo en alícuotas que comprenden una población mixta de células sin aislamiento de las células individuales.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichos análisis genéticos se seleccionan entre RFLP, T-RFLP, análisis en micromatriz, PCR cuantitativa y secuenciación de ácidos nucleicos.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende además analizar alícuotas de dicha muestra mediante una o más técnicas de caracterización de proteínas seleccionadas entre i) análisis cromatográficos que separan las proteínas de acuerdo con las propiedades fisicoquímicas, ii) análisis de digestiones proteolíticas de las proteínas homólogas, iii) secuenciación N-terminal "en masa" y iv) análisis usando moléculas detectoras específicas de las proteínas homólogas.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho análisis cromatográfico se basa en otra propiedad fisicoquímica diferente del tamaño.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que un análisis cromatográfico individual se basa en las propiedades fisicoquímicas seleccionadas entre i) carga neta, ii) hidrofobicidad, iii) puntos isoeléctricos, y iv) afinidad.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que dicho análisis cromatográfico se lleva a cabo como una cromatografía multidimensional.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el análisis de las digestiones proteolíticas de las proteínas homólogas se lleva a cabo con el fin de aislar péptidos marcadores N terminales o péptidos con funcionalidad característica de cadena lateral de aminoácidos.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dichas moléculas detectoras específicas son péptidos anti-idiotipo o anticuerpos anti-idiotipo.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho péptido anti-idiotipo o anticuerpo anti-idiotipo se utiliza en la determinación de las células que producen proteínas individuales en una línea celular policlonal.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 8, en el que dicha muestra se deriva de un sobrenadante de cultivo celular.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha caracterización se basa en el análisis de una o más proteínas centinela o secuencias de ácidos nucleicos centinela presentes en dicha muestra.

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se aplican al menos dos técnicas analíticas para analizar dicha muestras.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que una técnica analítica es una técnica de caracterización de proteínas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 8, y otra técnica analítica es un análisis genético de acuerdo con la reivindicación 2.

14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestras se obtienen de un único cultivo celular policlonal en diferentes momentos durante el cultivo y se comparan las proporciones relativas de dichas proteínas homólogas individuales y/o las secuencias de codificación.

15. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha muestras se obtienen de diferentes cultivos celulares policlonales en un momento concreto y se comparan las proporciones relativas de dichas proteínas homólogas individuales y/o las secuencias de codificación.

16. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las diferentes proteínas homólogas que tienen diferentes regiones variables son proteínas recombinantes.

17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que las proteínas recombinantes constituyen una proteína policlonal recombinante.

18. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las diferentes proteínas homólogas que tienen diferentes regiones variables son anticuerpos con diferentes regiones CDR.

19. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que las diferentes proteínas homólogas que tienen diferentes regiones variables son receptores de linfocitos T con diferentes regiones CDR.

20. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, que comprende un análisis cromatográfico basado en la carga neta, en el que las proteínas que presentan heterogeneidad de carga producida por la ciclación de los restos de glutamina N terminales se someten a un procedimiento para la eliminación de la heterogeneidad de carga N terminal producida por la ciclación de los restos de glutamina N terminales en las proteínas recombinantes, que comprende cambiar dicho resto de glutamina N terminal por otro aminoácido.

21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicho cambio se lleva a cabo mediante mutagénesis dirigida específica del sitio de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicha proteína.

22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, en el que dicho cambio se lleva a cabo en uno o más miembros individuales de una proteína policlonal.

23. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que dicha proteína es un anticuerpo o un receptor de linfocitos T.