Un procedimiento para la generación de una línea celular policlonal capaz de expresar una proteína policlonal que comprende de 2 a n miembros distintos,

dicho procedimiento comprende: a) Proporcionar un grupo de vectores de expresión, en donde cada uno de los vectores comprende al menos una copia de un ácido nucleico distinto que codifica un miembro distinto de la proteína policlonal; b) Transfeccionar por sepatado las células huésped con cada uno de los vectores de expresión bajo condiciones que eviten la integración específica del sitio de los vectores de expresión dentro del genoma de las células, obteniendo con esto 2 a n composiciones de células, cada composición expresa un miembro distinto de la proteína policlonal; c) Mezclar las 2 a n composiciones de las células para obtener una línea celular policlonal

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la producción de proteínas policlonales recombinantes, tales como proteínas provenientes de la superfamilia de las inmunoglobulinas, por ejemplo, formas solubles o unidas a membrana de los receptores de células B o T, usando sistemas de producción que son independientes de la integración específica del sitio.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Para numerosas enfermedades, tales como enfermedades infecciosas y tipos de cáncer, se carece de terapias eficientes. En general, los anticuerpos monoclonales no han tenido éxito contra todos estos objetivos, en parte debido a la variabilidad de los objetivos complejos y a las mutaciones adaptativas de las proteínas diana que provocan escape inmunitario del reconocimiento del anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos policlonales, por otra parte, pueden dirigirse a una pluralidad de objetivos dinámicos, por ejemplo, virus, bacterias o células cancerosas. Asimismo, los anticuerpos policlonales tienen la probabilidad más elevada de conservar la actividad en el caso de mutación antigénica.

Existen diferentes terapéuticas con anticuerpos policlonales comercialmente disponibles, que incluyen: 1) lnmunoglobulina humana normal aislada de sangre de donantes humanos normales; 2) inmunoglobulina hiperinmune humana derivada de sangre de donantes humanos individuales portadores de anticuerpos contra una enfermedad objetivo concreta, por ejemplo, un virus, que habían encontrado previamente ya sea a través de infección o de vacunación; y 3) inmunoglobulina hiperinmune animal derivada de sangre de animales inmunizados.

Se ha demostrado que la inmunoglobulina purificada a partir de sangre humana es efectiva contra infecciones por el virus de la hepatitis B, el virus sincitial respiratorio, el citomegalovirus y otros virus de herpes, el virus de la rabia, la toxina botulínica, etc., así como en la profilaxis de rhesus D neonatal. La inmunoglobulina purificada a partir de sangre de conejo inmunizada con células T humanas se usa para proporcionar inmunosupresión de las células T en el tratamiento o prevención del rechazo de trasplantes (por ejemplo, timoglobulina). La inmunoglobulina humana normal se ha usado para reforzar el sistema inmunitario de pacientes inmunodeficientes, así como la terapia de diversos trastornos autoinmunitarios.

Sin embargo, el uso muy difundido de inmunoglobulinas ha estado limitado debido a la restricción del suministro de materia prima de sangre de donaantes, problemas con las variaciones entre lotes y la seguridad variable. En particular, con las inmunoglobulinas derivadas de animales existen os mismos problemas de inmunogenicidad que los observados para los anticuerpos monoclonales derivados de animales en las décadas de 1980 y 1990. Finalmente, como con otros productos hemoderivados, sigue existiendo el riesgo de transmisión de agentes infecciosos tales como el VIH, virus de herpes o de hepatitis, o priones. En consecuencia, aunque los clínicos reconocen que los anticuerpos policlonales son una terapéutica preferida en algunas situaciones, su uso ha estado muy limitado.

Con las técnicas de animales transgénicos han surgido nuevos enfoques para generar inmunoglobulinas humanas. Se han creado ratones transgénicos que poseen loci de inmunoglobulinas humanas (patente de EE.UU. No. 6.111.166). Estos ratones producen inmunoglobulinas completamente humanas y pueden producirse anticuerpos contra un objetivo específico mediante las técnicas de inmunización usuales. Sin embargo, la obtención de mayores rendimientos de anticuerpos está limitada debido al tamaño relativamente pequeño de los ratones. También se han producido animales transgénicos más grandes para los genes de las inmunoglobulinas humanas, por ejemplo vacas (Kurolwa, Y. y col. Nature Biotechnology; 2002; 20:889-893). Sin embargo, la producción de anticuerpos policlonales para terapia a partir de la sangre de tales animales no está exenta de complicaciones. En primer lugar, la inmunofisiología del animal y de los seres humanos puede mostrar diferencias considerables, lo que provoca diferencias en el repertorio inmunitario resultante, la reordenación funcional y la diversidad de la respuesta de anticuerpos. En segundo lugar, la inestabilidad mitótica de los loci de inmunoglobulina introducidos pueden influir sobre la producción de anticuerpos a largo plazo. En tercer lugar, es técnicamente un reto suprimir los loci de inmunoglobulina propios del animal, de modo que, por ejemplo, la producción de anticuerpos del animal no exceda la producción de anticuerpos humanos. En cuarto lugar, el riesgo de transmisión de agentes infecciosos, tales como virus, priones u otros patógenos, acompaña la administración de los anticuerpos humanos producidos en animales.

Recientemente se ha desarrollado un nuevo tipo de anticuerpos policlonales que es independientemente de la disponibilidad del donanate en el momento de la producción. Estos anticuerpos policlonales se generan mediante el aislamiento de secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo provenientes de donanates con una respuesta inmunitaria contra el objetivo deseado, seguido por la selección para los anticuerpos que se unen específicamente al objetivo deseado. El anticuerpo policlonal puede fabricarse mediante una tecnología adaptada de expresión en mamíferos, que se basada en la integración específica de sitio de un plásmido de expresión del anticuerpo dentro del mismo sitio genómico de cada célula, como se describe en el documento WO 2004/061104. Un ejemplo de este nuevo tipo de anticuerpos policlonales es un anticuerpo policlonal recombinante contra Rhesus D (WO 2006/007850). El uso de la integración específica de sitio da como resultado una población celular en la que cada célula contiene una única copia y en la que se espera que los niveles de expresión y las tasas de crecimiento sean relativamente uniformes.

El documento 2004/029284 da a conocer un sistema de expresión celular específico de sitio capaz de intercambiar al menos un gen diana, en el que el sistema comprende un primer casete de integración, un primer casete diana y al menos un elemento rec que codifica al menos una actividad recombinasa que reconoce los sitios de reconocimiento de la recombinasa de los casetes.

El documento 2006/007853 da a conocer procedimientos para la caracterización estructural de un anticuerpo policlonal recombinante u otra proteína policlonal recombinante o una línea celular policlonal productora de dicha proteína, con el fin de verificar la consistencia entre lotes de los productos finales, así como la estabilidad de la composición durante los ciclos de producción sencillos.

Wiberg y col. (Biotechn. Bioeng. (2006) 94(2): 396-405) describen la expresión y producción de un anticuerpo policlonal recombinante anti-rhesus D que comprende 25 anticuerpos de IgG1 humana basadas en la integración específica de sitio de genes de anticuerpos en células CHO.

Huang Y COL. (J. Immunol. Methods (Abril 2007) 322 (1-2): 28-39) describen un sistema de integración de genes en vectores celulares dirigidos para la expresión de niveles elevados de anticuerpos usando una estrategia FRT/FLP para superar los efectos de posición.

Haurum y col. (IDrugs (2005) 8(5); 404-9) revisan el desarrollo de terapéuticas con anticuerpos de inmunoglobulinas humanas de primera generación a anticuerpos monoclones recombinantes de segunda generación a anticuerpos policlonales recombinantes.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona procedimientos alternativos para la producción de una proteína policlonal recombinante, que son independientes de la integración específica de sitio y, por lo tanto, proporcionan mayor flexibilidad con respecto a la elección de la línea celular de producción, al tiempo que mantienen la policlonalidad de la proteína. Además, los niveles de expresión pueden ser más altos que los que son posibles con la integración específica de sitio.

El enfoque de la presente invención está basado en la integración aleatoria de los genes individuales de interés dentro de las células huésped, seguida, preferentemente, por la clonación de células simples con las características deseadas. Los clones celulares individuales, cada uno de los cuales produce un miembro individual de la proteína policlonal, se mezclan después con el fin de generar una línea celular de fabricación policlonal para la

producción de una proteína policlonal.

Los anticuerpos...

1. Un procedimiento para la generación de una línea celular policlonal capaz de expresar una proteína policlonal que comprende de 2 a n miembros distintos, dicho procedimiento comprende:

a) Proporcionar un grupo de vectores de expresión, en donde cada uno de los vectores comprende al menos una copia de un ácido nucleico distinto que codifica un miembro distinto de la proteína policlonal;

b) Transfeccionar por sepatado las células huésped con cada uno de los vectores de expresión bajo condiciones que eviten la integración específica del sitio de los vectores de expresión dentro del genoma de las células, obteniendo con esto 2 a n composiciones de células, cada composición expresa un miembro distinto de la proteína policlonal;

c) Mezclar las 2 a n composiciones de las células para obtener una línea celular policlonal.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado porque los vectores de expresión son estable y aleatoriamente integrados dentro de uno o más cromosomas de las células huésped.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que las células transfeccionadas obtenidas en la etapa b) son clonadas, por ejemplo usando clonación por FACS, y, preferentemente, en el que los clones se seleccionan segùn al menos un criterio seleccionado del grupo constituido por: la velocidad de crecimiento, el tiempo de duplicación, el nivel de expresión, la nivel de producción, la estabilidad de la producción en el tiempo, la viabilidad, la resistencia, la solidez, la morfología y el número de copias.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que los clones se seleccionan según la uniformidad con respecto al menos a un criterio, por ejemplo en el que los clones se seleccionan según la uniformidad con respecto al tiempo de duplicación y/o el nivel de expresión, opcionalmente en el que se selecciona más de un clon para cada miembro de proteína policlonal distinto.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las composiciones de células que expresan diferentes miembros distintos se mezclan en una

proporción 1:1, o en el que dichas composiciones de células se mezclan en una proporción diferente de una proporción 1:1.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en e que los vectores de expresión son idénticos, excepto por las variaciones en la secuencia de codificación de la proteína policlonal.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células huésped derivan de un clon antes de la transfección.

8. El procedimiento de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína policlonal es una proteína multimérica, por ejemplo en el que un vector de expresión codifica todas las subunidades de un miembro de proteína policlonal distinta o en el que el grupo de vectores de expresión en la etapa a) está constituido por dos o más subgrupos de vectores de expresión, donde un primer subgrupo comprende las secuencias variantes de ácido nucleicos que codifican una subunidad de la proteína, por ejemplo la cadena pesada de un anticuerpo, y un segundo subgrupo comprende la secuencia de variantes de ácido nucleicos que codifica otra subunidad de la proteína, por ejemplo la cadena ligera de un anticuerpo, tal que cada transfección se realiza con un miembro proveniente del primer grupo y un miembro del segundo grupo de vectores de expresión.

9.1El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, parqueen el que el vector de expresión o un vector de expresión adicional codifica un marcador seleccionable, por ejemplo en el que las células se cultivan de forma continua en condiciones que favorecen el crecimiento de las células que expresan el marcador seleccionable, por ejemplo en el que el marcador seleccionable comprende un producto génico, en el cual es deficiente la célula huésped, por ejemplo en el que el marcador seleccionable está codificado por un tránscrito que también codifica un miembro polipeptídico o una subunidad del miembro polipeptídico, preferentemente en el que el marcador seleccionable está codificado por el tránscrito que codifica la subunidad más grande.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína policlonal es un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo policlonal, en el que todos los miembros del anticuerpo policlonal tienen la misma región constante de la cadena pesada y/o ligera, preferentemente de la cadena pesada.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células huésped son células eucarióticas, preferentemente células de mamífero, por ejemplo células de mamífero seleccionadas del grupo que consiste en células de ovario de hámster Chino (CHO) células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0, NSO, YB2/0), NIH 3T3, células humanas inmortalizadas o de fibroblastos, incluyendo células HeLa, células HEK293, o PER.C6.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la célula huésped expresa un transactivador recombinante, capaz de transactivar el promotor que codifica la expresión de la proteína policlonal.

13. Un procedimiento para la fabricación de una proteína policlonal, comprendiendo dicho procedimiento: a) proporcionar una línea celular policlonal obtenida utilizando el procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; b) cultivar la línea celular policlonal bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína policlonal; c) recuperar y opcionalmente purificar la proteína policlonal a partir de las células o del medio; y, opcionalmente,

d) verificar la presencia de cada uno de los distintos miembros en la proteína policlonal recuperada y opcionalmente purificada.

14. Una línea celular policlonal que comprende de 2 a n poblaciones de células, expresando cada población una población de miembros distintos de la proteína policlonal recombinante, en la que la proteína policlonal recombinante comprende moléculas de proteína diferentes pero homólogas, las células comprenden al menos un construccto de expresión aleatoriamente integrado dentro del genoma, tal que los sitios de integración varían entre los miembros de la línea de células policlonales.

15. La línea de células policlonales de la reivindicación 14, en la que al menos un constructo de expresión está integrado en uno o más cromosomas.

16. La línea de células policlonales de la reivindicación 14 ó 15, en la que n es menor de 50, tal como menor de 45, por ejemplo menor de 40, tal como menor de 35, por ejemplo menor de

30.

17. La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en la que las células que expresan un miembro distinto de la proteína policlonal recombinante derivan de 2 ó más células clonadas, y en la que el número de células clonadas es inferior a 50, por ejemplo inferior a 20, tal como inferior a 15, por ejemplo inferior a 10.

18. La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en la que la proteína policlonal es una proteína multimérica, por ejemplo en la que cada constructo de expresión codifica las subunidades de una proteína multimérica, por ejemplo en la que la expresión de las subunidades está bajo el control de los mismos o idénticos promotores.

19, La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-18, en la que los constructos de expresión codifica un marcador seleccionable, opcionalmente en la que el marcador seleccionable está codificado por un tránscrito que también codifica un miembro polipeptídico o una subunidad del miembro polipeptídico.

20. La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-19, en la que la proteína policlonal es un anticuerpo policlonal o fragmento de anticuerpo policlonal, preferentemente en el que todos los miembros del anticuerpo policlonal son del mismo isotipo.

21. La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-20, en la que las células huésped son células eucarióticas, preferentemente en la que las células huésped son células de mamífero.

22. La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-21, en la que las células comprenden un constructo de expresión establemente integrada que codifica un transactivador capaz de transactivar el promotor que codifica los miembros de la proteína policlonal.