ANTICUERPOS ANTI-CD28.

Proteína capaz de unirse específicamente al receptor linfocitario CD28 y bloquear la interacción CD28/B7,

caracterizada porque comprende al menos las CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina CD28.3 producida por el hibridoma CNCM I-2582, y porque se elige de entre: a) el anticuerpo CD28.3 producido por el hibridoma CNCM I-2582; b) los fragmentos Fv, Fab o scFv del anticuerpo CD28.3; c) los anticuerpos quiméricos o humanizados obtenidos a partir de las regiones variables de CD28.3; d) los fragmentos Fv, Fab o scFv de un anticuerpo quimérico o humanizado c); e) las proteínas recombinantes que incluyen un fragmento b) o d) y un polipéptido heterólogo

La invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra el receptor linfocitario CD28, a sus fragmentos, así como a sus utilizaciones terapéuticas, en particular en el marco de la regulación de la activación de las células T.

En la patogénesis de numerosas enfermedades autoinmunes, así como en fenómenos de rechazo de injertos, provocando el desarrollo de una respuesta inmune dirigida contra el injerto, aparece una activación anormal de las células T.

La activación de los linfocitos T necesita una señal activadora inducida por el reconocimiento, por los receptores T (TCR), del antígeno asociado al complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase II y presentado por las células presentadoras del antígeno (CPAg). Sin embargo, esta activación sólo provoca la proliferación de células T y la secreción de citoquinas inmunomoduladoras específicas (tales como interleucina 2, interferón gamma o interleucina 4), cuando se activan también otros sistemas de coestímulo T.

Uno de los sistemas más importantes de regulación de la activación de los linfocitos T es el sistema molecular B7/CD28/CTLA4. Este sistema desempeña, por ejemplo, un papel esencial en los mecanismos de rechazo de injertos [WOODWARD y col., Transplantation, 66, 14-20, (1998)]. Las moléculas B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86), llevadas por las CPAg, pueden activar el receptor CD28 y el receptor CTLA4 de los linfocitos T. La activación del CD28 suministra al linfocito T una señal positiva que estimula la célula; en cambio, la activación del CTLA4 suministra una señal negativa que conduce a una no respuesta (anergia) [FALLARINO y col., J. Exp. Med., 188, 205-210, (1998)].

Los linfocitos T en reposo expresan una cantidad importante de CD28 y muy poca de CTLA4. En un primer contacto cognitivo entre una CPAg y un linfocito T, prevalece la interacción CD28/B7, lo que activa la célula. Sólo varias horas después de la iniciación de la activación, debido al incremento de la expresión membranaria de CTLA4, cuya afinidad con B7 es 5 a 10 veces superior a la del CD28, la interacción B7/CD28 se desplaza a beneficio de una interacción B7/CTLA4.

Actualmente, para bloquear la activación de los linfocitos T, en particular en el marco de los transplantes de órganos, se utiliza principalmente la ciclosporina. A pesar de la eficacia de este medicamento, la protección que confiere no es absoluta. Además, actúa bloqueando todas las vías de activación celulares dependientes del calcio y, por tanto, posee una actividad biológica que no es estrictamente específica de los linfocitos T y provoca muchos efectos secundarios. Por ello, es deseable desarrollar nuevos inmunosupresores con un mecanismo de acción definido y de mayor especificidad.

Se ha postulado que la inhibición selectiva de la señal agonista proporcionada a la célula T por el CD28 dejando intacto el sistema antagonista constituido por la pareja CTLA4/B7 mediante un bloqueo específico de la interacción CD28/B7 permitiría prevenir la activación de los linfocitos T. Dicho bloqueo específico de la interacción CD28/B7 puede obtenerse gracias a un anticuerpo dirigido contra CD28.

Son conocidos anticuerpos anti-CD28 capaces de impedir la unión de CD28 con B7. Sin embargo, cuando se utilizan en su forma nativa divalente, presentan el inconveniente de provocar la dimerización y activación de CD28 por su unión a este receptor. Sin embargo, fragmentos monovalentes procedentes de estos anticuerpos son capaces de bloquear, sin activarlo, el receptor CD28 [DAMLE y col., J. Immunol., 140, 1753-1761, (1988); NUNES y col., Int. Immunol., 5, 311-315, (1993); PAGES y col., J. Biol. Chem., 271, 9403, (1996)].

Así, se ha reportado [PERRIN y col., J. Immunol. 163, 1704-1710, (1999)] que fragmentos Fab procedentes de un anticuerpo anti-CD28 podían detener los síntomas clínicos de la encefalitis experimental autoinmune inducida en el ratón por la administración de mielina o por la transferencia de células T de un animal afectado.

Fragmentos monovalentes Fab o scFv derivados de un anticuerpo antiCD28 se pueden utilizar potencialmente para prevenir la activación de los linfocitos T por medio de un bloqueo específico de la interacción CD28/B7.

Los fragmentos Fab resultan de la acción de la papaína sobre una molécula de inmunoglobulina y contienen cada uno una cadena ligera y la primera mitad de una cadena pesada; los fragmentos scFv están constituidos por porciones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo unidas entre sí por intermediación de un ligante flexible [CLACKSON y col., Nature, 352, 624-628, (1991)], formando así una proteína de cadena simple.

Con frecuencia, estos fragmentos monovalentes presentan una afinidad por el antígeno menos importante que la de los anticuerpos nativos, lo que puede limitar sus posibilidades de utilización en aplicaciones diagnósticas o terapéuticas.

Los inventores han logrado seleccionar, de entre distintos anticuerpos que reconocen el antígeno CD28, un anticuerpo capaz de bloquear la interacción CD28/B7, cuyos fragmentos monovalentes presentan una afinidad suficiente por el antígeno como para que sean útiles, in vitro o in vivo, en el bloqueo del receptor CD28, sin que se produzca la activación de este receptor.

Este anticuerpo, llamado CD28.3, es producido por el hibridoma depositado según los términos del tratado de Budapest, a 28 de noviembre de 2000, en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15) bajo el número I-2582.

La presente invención tiene por objeto una proteína capaz de unirse específicamente al receptor linfocitario CD28 y bloquear la interacción CD28/B7, caracterizada porque comprende al menos las CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina CD28.3, y que se seleccionan de entre:

a) el anticuerpo CD28.3 producido por el hibridoma CNCM I-2582;

b) los fragmentos Fv, Fab o scFv del anticuerpo CD28.3;

c) los anticuerpos quiméricos o humanizados obtenidos a partir de las regiones variables de CD28.3;

d) los fragmentos monovalentes Fv, Fab o scFv de los anticuerpos c) mencionados más arriba que comprenden las CDR del anticuerpo CD28.3;

e) las proteínas recombinantes que incluyen un fragmento b) o d) y un polipéptido heterólogo.

Las CDR (regiones que determinan la complementariedad) son aquellas porciones de las regiones variables de una inmunoglobulina implicadas en la especificidad de reconocimiento del antígeno.

Así, las proteínas según la invención abarcan en particular:

 proteínas que asocian al menos un fragmento de anticuerpo, que comprende las CDR del anticuerpo CD28.3, a al menos un fragmento de anticuerpo que incluye las CDR de un anticuerpo de diferente especificidad; a modo de ejemplo, se mencionan inmunoglobulinas biespecíficas, conjugados de un fragmento Fv o Fab que contienen las CDR de CD28.3 con un fragmento Fv o Fab de un anticuerpo de diferente especificidad, “diacuerpos biespecíficos” que resultan de la asociación de un fragmento scFv que contiene las CDR de CD28.3 a un fragmento Fv o Fab de un anticuerpo de diferente especificidad;

 proteínas que asocian al menos un fragmento de anticuerpo que comprende las CDR del anticuerpo CD28.3 a una molécula provista de actividad farmacológica (por ejemplo una toxina) o de propiedades efectoras (por ejemplo un fragmento Fc);

 proteínas que asocian al menos un fragmento de anticuerpo que comprende las CDR del anticuerpo CD28.3 a una molécula que permite prolongar su vida media plasmática durante su administración in vivo; por ejemplo, se puede asociar dicho fragmento de anticuerpo a un polipéptido hidrosoluble de masa molecular suficiente para que la masa molecular del polipéptido de fusión así obtenido sea superior al umbral de filtración renal. En este caso, se elegirá un polipéptido que, contrariamente a los fragmentos Fc, no pueda asociarse en dímeros y que no posea actividad efectora propia susceptible de provocar efectos secundarios inoportunos. Se pueden obtener ventajosamente polipéptidos que poseen estas propiedades a partir de proteínas séricas hidrosolubles, a saber: en particular seroalbúmina, haptoglobulina, ITIH2 (inhibidor inter-alfa (globulina), polipéptido H2), transferrina, CBG (proteína ligante de corticosteroides), α-1 antitripsina, ITIH4 (inhibidor inter-alfa (globulina), polipéptido...

1. Proteína capaz de unirse específicamente al receptor linfocitario CD28 y bloquear la interacción CD28/B7, caracterizada porque comprende al menos las CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina CD28.3 producida por el hibridoma CNCM I-2582, y porque se elige de entre:

a) el anticuerpo CD28.3 producido por el hibridoma CNCM I-2582;

b) los fragmentos Fv, Fab o scFv del anticuerpo CD28.3;

c) los anticuerpos quiméricos o humanizados obtenidos a partir de las regiones variables de CD28.3;

d) los fragmentos Fv, Fab o scFv de un anticuerpo quimérico o humanizado c);

e) las proteínas recombinantes que incluyen un fragmento b) o d) y un polipéptido heterólogo.

2. Proteína según la reivindicación 1, caracterizada porque se trata de una proteína recombinante que comprende:

- un fragmento scFv del anticuerpo CD28.3, y

- un polipéptido heterólogo obtenido a partir de la α1-antitripsina.

3. Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3.

5. Vector de expresión según la reivindicación 4, caracterizado porque se trata del plásmido CNCM I-2762.

6. Célula que expresa una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

7. Célula según la reivindicación 6, caracterizada porque se trata del hibridoma CNCM I-2582.

8. Célula según la reivindicación 6, caracterizada porque se trata de una célula transformada por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3.

9. Proceso de preparación de una proteína según cualquiera de las

reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque comprende el cultivo de al menos una célula según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, así como la recuperación de dicha proteína a partir de dicho cultivo.

10. Utilización de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para la obtención de un medicamento.

10 11. Utilización según la reivindicación 10, caracterizada porque dicha proteína posee un único sitio de unión al receptor CD28 y porque dicho medicamento es un inmunosupresor que bloquea selectivamente la activación de las células T por medio del receptor CD-28.

12. Utilización según la reivindicación 11, caracterizada porque dicho medicamento está destinado al tratamiento de una patología seleccionada de entre rechazo de injerto, enfermedad injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes mediadas por linfocitos T, fenómenos alérgicos, así como enfermedades inflamatorias crónicas.