MICROPARTICULAS CON ANTICUERPOS MONOCLONALES ESPECIFICOS DE CD28.

Micropartículas con una estructura de soporte respecto de lo cual en esta estructura de soporte se enlazan exclusivamente anticuerpos superagonísticos monoclonales (mAb) específicos de CD28 o un enlace por mimetismo

Micropartículas con anticuerpos monoclonales específicos de CD28.

Disciplina o sector en el que tiene lugar la invención

El invento es relativo a unas micropartículas con una estructura de soporte y con un anticuerpo monoclonal (mAb) enlazado a la estructura de soporte, el empleo de semejantes anticuerpos así como un procedimiento para la producción de semejantes micropartículas.

Trasfondo de la invención y estado de la técnica

Existen diversas enfermedades propias de las especies tanto humana como animales de sangre caliente en las cuales la cantidad de la diversas células sanguíneas es inferior a la que se tiene en estado de salud o bien es de insuficiente actividad.

Uno de estos grupos de enfermedades se da en el caso de una reducción patológica de la cantidad de células T, especialmente la cantidad de células T-CD4 conjuntas como, por ejemplo, sucede en el caso del SIDA o de las enfermedades leucémicas y el estado subsiguiente a las quimioterapias y radioterapias.

Un segundo grupo de enfermedades en las que la cantidad o la actividad de cierto subgrupo concreto de células T que en el caso de las personas sanas mantienen la tolerancia inmunológica se encuentran disminuidas o bien afectadas en su funcionamiento y abarca las enfermedades autoinmunológicas e inflamatorias. Ejemplos de ello son la artritis reumatoide, enfermedades inflamatorio-intestinales, diabetes en la que sea obligado el suministro de insulina, esclerosis múltiple así como el síndrome de Guaillan-Barre.

Un tercer grupo de enfermedades se llama granulocitopenia (por ejemplo neutropenia) o bien monocitopenia y afecta a los granulocitos. Las causas de esta enfermedad pueden ser : i) granulocitopoyesis reducida o bien monocitopoyesis (transtorno aplástico) por causa de una lesión de la médula ósea como, por ejemplo, por causa de agentes químicos como el benzol, medicamentos como los citostáticos, inmunosupresores, AZT y/o cloramfenicol (tóxico dependiendo de la dosis) o como fenilbutazona, compuestos del oro, raras veces cloramfenicol (independientemente de la dosis por reacción farmacocinética), radiación o autoanticuerpos contra las células madre (en algunos casos de inmunoneutropenia), por causa de infiltración de médula ósea(leucemia, carcinoma, linfoma maligno) y/o por causa de osteomielosclerosis, ii) transtornos en la maduración de la granulocitopoyesis, por ejemplo por causa de transtornos congénitos de la maduración de la mielopoyesis, síndrome de Kostmann (detención de la maduración de la mielopoyesis en el estadio de los promielocitos), neutropenia cíclica, síndrome de mielodisplasia, carencia de vitamina B12 o ácido fólico con granulocitopoyesis, eritropoyesis y/o trombopoyesis inefectivas. Las terapias habituales abarcan el suministro de factores del crecimiento de la granulocitopoyesis (por ejemplo G-CSF y GM-CSF).

Un cuarto grupo se llama trombocitopenia. En tanto causas cabe mencionar: i) la trombocitopoyesis reducida en la médula ósea (transtorno aplástico o bien una cantidad reducida de megacariocitos en la médula ósea) por causa de lesiones de la médula óseas, por ejemplo por efecto de agentes químicos como el benzol, medicamentos como los citostáticos y/o inmunosupresores, radiación, infecciones como, por ejemplo, VIH o anticuerpos contra los megacariocitos (en algunos casos de inmunotrombocitopenia), por causa de infiltración de la médula ósea (leucemia, carcinoma, linfoma maligno) y/o por causa de osteomielosclerosis, ii) transtornos de la maduración de los megacariocitos (cantidad de megacariocitos en la médula ósea normal o aumentada) con trobopoyesis, eritropoyesis y/o granulocitopoyesis inefectiva con normoblastos, metamielocitos gigantes entre otros por causa de carencia de vitamina B12 o ácido fólico. Las terapias habituales abarcan la supresión de medicamentos sospechosos, substitución de trombocitos (en el caso de transtornos de la formación en la médula ósea: trombopoetina) así como MGDF (estimulación de la proliferación y maduración de los megacariocitos).

Un quinto grupo está conformado por las anemias aplástidas o bien la disfunción de la médula ósea con aplasia/hipoplasia de la médula ósea misma y pancitopenia (enfermedad de las células madre). Una anemia aplástica congénita es, por ejemplo, la anemia de Fanconi. Más frecuentes son las anemias aplástidas adquiridas como las anemias idiopáticas aplásticas (de causa desconocida) y las anemias aplásticas secundarias por causa de los medicamentos, substancias tóxicas, radiaciones ionizantes e infecciones virales (véase arriba). Los enfoques de los tratamientos de mantenimiento abarcan la substitución de los eritrocitos/trombocitos. Los enfoques de tratamiento causales abarcan el transplante de médula ósea o de células madre, terapias inmunosupresivas (por ejemplo ATG) y demás medidas terapéuticas como el suministro de citocinas (GM-CSF, G-CSF, MGDF, y/o trombopoetina).

Finalmente junto con la leucemia aguda se da frecuentemente anemia, trombocitopenia y/o granulocitopenia. Las terapias abarcan la substitución de eritrocitos y trombocitos según se requiera o bien la estimulación de la granulocitopoyesis por G-CSF y/o GM-CSF, quimioterapia y transplante de células óseas y/o células madre.

Las anteriormente citadas enfermedades del primer y el segundo grupo comparten el hecho de que las células sanguíneas afectadas son aquellas que portan en su superficie el CD28. Los grupos que van del tercero al sexto comparten el hecho de que las células sanguíneas afectadas son aquellas que, por el contrario, no porten el CD28 en su superficie.

Para comprender la invención es primeramente importante considerar el trasfondo tecnológico que a continuación se ilustra. La activación de las células T en reposo con vistas a la proliferación y la diferenciación funcional requiere, en primer lugar, la ocupación de estructuras superficiales dobles, los llamados receptores; primero, del receptor del antígeno, que posee una especificidad diferente de célula a célula y que es necesaria para el reconocimiento de antígenos como, por ejemplo, productos de disociación virales; así como la molécula CD28 expresada del mismo modo en todas las células T en reposo, la cual se une de un modo natural a ligandos sobre la superficie de otras células del sistema inmunológico. Cabe mencionar a este respecto la expresión de "coestimulación" relativa a la inmunoreacción específica de antígeno por medio de CD28. En el cultivo celular pueden reproducirse estos procesos por ocupación del receptor de antígeno así como de la molécula CD28 con los anticuerpos monoclonales apropiados. En el sistema clásico de la coestimulación ni la ocupación del receptor de antígenos ni de la molécula CD28 solo tienen por consecuencia la proliferación celular T, no obstante la ocupación de ambos receptores es efectiva. Esto mismo se ha observado en células T tanto humanas como de ratones y ratas.

Por el contrario se conocen también anticuerpos monoclonales específicos de CD28 que pueden causar por sí mismos la proliferación de células T. Semejante activación superagonística, es decir, una activación independiente de la ocupación del receptor de antígeno de linfocitos T en reposo a través de anticuerpos monoclonales específicos de CD28, se ha observado en el siguiente sistema: en la nota de bibliográfica de Brinkmann et al., J. Immunology, 1996,156 : 4100-4106 se mostró que una muy reducida porción (del 5%) de los linfocitos T humanos que, por carecer del marcador de superficie CD45 RO pueden asignarse al grupo de linfocitos T en reposo, se activa por medio de los anticuerpos monoclonales específicos de CD28 9.3, que normalmente requieren coestimulación, en caso de adición del factor de crecimiento interleucina 2 (IL-2) sin ocupación del receptor de antígeno. En el trabajo de Siefken et al., Cellular Immunology, 1997, 176: 59-65, se mostró que por vías convencionales, es decir, por medio de inmunizar a ratones con células T humanas, los anticuerpos monoclonales específicos de CD28 producidos pueden activar en cultivos celulares un subgrupo de células T humanas sin ocupación de receptor de antígeno con vistas a la proliferación siempre que el CD28 sea ocupado por estos anticuerpos monoclonales y las moléculas monoclonales ligadas celularmente se enlacen además conformando una red entre sí por la acción de otros anticuerpos. Estos anticuerpos comparten la característica de que tan sólo una porción reducida de las células T puede activarse.

En el trabajo de Tacke et al.., Eur. J. Immunol., 1997, 27:239-247 se describen dos tipos...

1. Micropartículas con una estructura de soporte respecto de lo cual en esta estructura de soporte se enlazan exclusivamente anticuerpos superagonísticos monoclonales (mAb) específicos de CD28 o un enlace por mimetismo.

2. Micropartículas según la reivindicación 1, a lo cual los anticuerpo monoclonal se enlazan directa y preferentemente de un modo covalente a la superficie de la estructura de soporte.

3. Micropartículas según la reivindicación 1, a lo cual los anticuerpo monoclonal se enlazan indirectamente a la superficie de la estructura de soporte por medio de un enlace de espaciador enlazado preferentemente de modo covalente a la superficie de la estructura de soporte.

4. Micropartículas según la reivindicación 3, a lo cual el enlace de espaciador seleccionado forma parte del grupo de "polímeros orgánicos, péptidos, proteínas y combinaciones de semejantes substancias".

5. Micropartículas según una de las reivindicaciones de 1 a 4, a lo cual la superficie de la estructura del portador se conforma por medio de un polímero orgánico que preferentemente se selecciona del grupo conformado por "poliestireno, poliuretano, poliéster, polivinilpiridina, polivinilamina, polietilenimina, chitosan y mezclas de semejantes polímeros".

6. Micropartículas según la reivindicación 5, a lo cual el polímero orgánico muestra grupos reactivos como, por ejemplo, glicidil éter.

7. Micropartículas según la reivindicación 5 o 6, a lo cual el polímero orgánico se encuentra activado en lo que respecta a la superficie por medio del tratamiento con un reactivo de activación, el cual es preferentemente el p-tolueno sulfonilo cloruro.

8. Micropartículas según unas de las reivindicaciones de 1 a 7, a lo cual el diámetro de la estructura de soporte se encuentra en la gama de 0,1 µm a 100 µm, preferentemente en la gama de 1 µm a 20 µm y especialmente en la gama de 1 µm a 10 µm.

9. Micropartículas según una de las reivindicaciones de 1 a 8, a lo cual la superficie de la estructura de soporte (medida según el método BET) es de una a diez veces mayor, preferentemente de una a cuatro veces mayor a la superficie geométrica partiendo de que ésta fuera una superficie esférica lisa.

10. Empleo de micropartículas según una de las reivindicaciones de la 1 a la 9 para la producción de un agente destinado a la estimulación de las células sanguíneas, especialmente los linfocitos T, linfocitos B, granulocitos, monocitos y/o trombocitos.

11. Empleo según la reivindicación 10 con el fin de producir una composición farmacéutica para tratar las enfermedades en que se da un número reducido de células sanguíneas, especialmente un número reducido de linfocitos T o bien enfermedades inmunopatológicas o bien para potenciar la inmunoreacción con motivo de las vacunas, a lo cual se toma de un paciente una prueba de sangre, a saber, discrecionalmente aislando las células sanguíneas de la prueba de sangre y cultivando las células sanguíneas in vitro añadiendo una dosis fisiológicamente activa de micropartículas de modo que las células sanguíneas de este modo obtenidas se preparen galénicamente bien en tanto inyección bien en tanto infusión.

12. Empleo según la reivindicación 10 a fin de producir una composición farmacéutica para tratar enfermedades en las que se dé un número reducido de células sanguíneas o bien enfermedades inmunopatológicas o bien a fin de potenciar la inmunoreacción con motivo de las vacunas, a lo cual las micropartículas se preparan galénicamente preferentemente en tanto inyección o infusión.

13. Procedimiento para la producción de micropartículas según una de las reivindicaciones de la 1 a la 9 y según las siguientes fases procesales:

a)        se producen micropartículas con una superficie a crear partiendo de uno o varios tipos de organismos poliméricos,

b)        opcionalmente la superficie puede activarse,

c)        las micropartículas así obtenidas se incuban con una solución que contiene anticuerpo monoclonal superagonísticos específicos de CD28, a lo cual los anticuerpo monoclonales se encuentran de modo preferente covalentemente enlazados a la superficie o bien

c')        las micropartículas así obtenidas primeramente se incuban con una solución que contiene un enlace de espaciador, a lo cual el enlace de espaciador ha de encontrarse de modo preferente covalentemente enlazado a la superficie; discrecionalmente sigue después una fase de procedimiento de lavado y seguidamente se incuban las micropartículas con el enlace de espaciador enlazado y con una solución que contiene los anticuerpo monoclonal superagonísticos específicos de CD28, a lo cual los anticuerpo monoclonal se enlazan covalente o no covalentemente al enlace de espaciador y

e)        las partículas así obtenidas que contienen los anticuerpo monoclonal superagonísticos específicos de CD28 se separan de la solución y se someten opcionalmente a una fase de proceso de lavado.