Un anticuerpo monoclonal humano que se une a CTLA-4, o un fragmento ligante de antígenos del mismo,

en que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 9 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a la misma, y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 22 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a la misma, anticuerpo o fragmento que tiene las propiedades siguientes:

(a) una afinidad ligante por CTLA-4 de 10-9 M o mayor;

(b) inhibe la unión entre CTLA-4 y B7-1 con una IC50 de 100 nM o menor;

(c) inhibe la unión entre CTLA-4 y B7-2 con una IC50 de 100 nM o menor; y

(d) potencia la producción de citocinas en un ensayo de células T humanas en 500 pg/ml o mayor

Anticuerpos monoclonales humanos contra CTLA-4

Fundamento del invento

La presente solicitud reivindica prioridad con respecto a la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU., nº de serie 60/113.647, presentada el 23 de Diciembre de 1998, cuya descripción se incorpora aquí en su totalidad.

De acuerdo con el presente invento, se proporcionan anticuerpos monoclonales totalmente humanos contra el antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4; del inglés, cytotoxic T-lymphocyte antigen 4) humano. Se proporcionan secuencias nucleotídicas que codifican, y secuencias de aminoácidos que comprenden, moléculas inmunoglobulínicas de cadenas pesadas y ligeras, particularmente secuencias contiguas de cadenas pesadas y ligeras que abarcan las regiones determinantes de complementariedad (CDRs; del inglés, complementarity determining regions), específicamente de en FR1 y/o CDR1 a CDR3 y/o en FR4.

La regulación de la respuesta inmune de pacientes proporcionaría un tratamiento deseable de muchas enfermedades humanas que podría conducir a una especificidad de acción que se encuentra raramente mediante el uso de fármacos convencionales. Sería posible tanto la suprarregulación como la infrarregulación de respuestas del sistema inmune. Los papeles de las células T y las células B han sido ampliamente estudiados y caracterizados en relación con la regulación de la respuesta inmune. A partir de estos estudios, parece que, en muchos casos, el papel de las células T es particularmente importante en la prevención y el tratamiento de enfermedades.

Las células T poseen unos sistemas muy complejos para controlar sus interacciones. En las interacciones entre células T se utilizan numerosos receptores y factores solubles para el proceso. De este modo, el efecto que una señal concreta puede ejercer sobre la respuesta inmune generalmente varía y depende de los factores, receptores y contrarreceptores concretos que están implicados en la ruta. Las rutas para las respuestas de infrarregulación son tan importantes como las necesarias para la activación. La instrucción tímica que conduce a la tolerancia de las células T es un mecanismo para evitar una respuesta inmune hacia un antígeno concreto. También se conocen otros mecanismos, tal como la secreción de citocinas supresoras.

La activación de células T requiere no sólo la estimulación a través del receptor antigénico [receptor de células T (TCR; del inglés, T cells receptor)] sino también una señalización adicional a través de moléculas superficiales coestimulantes, tal como CD28. Los ligandos de CD28 son las proteínas B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86), que se expresan en células presentadoras de antígeno (APC; del inglés, antigen-presenting cells) tales como células dendríticas, células B activadas o monocitos que interaccionan con CD28 de células T o CTLA-4 para proporcionar una señal coestimulante. El papel de la señalización coestimulante fue estudiado por Perrin et al., Immunol. Res. 14: 189-99 (1995) en la encefalomielitis alérgica experimental (EAE). La EAE es un trastorno autoinmune provocado por células Th1 dirigidas contra antígenos de mielina, que proporciona un modelo in vivo para estudiar el papel de la coestimulación mediada por B7 en la inducción de una respuesta inmune patológica. Utilizando un ligando de proteína de fusión soluble para los receptores de B7, así como anticuerpos monoclonales específicos para CD80 o CD86, Perrin et al. demostraron que la coestimulación de B7 desempeña un papel destacado a la hora de determinar el resultado de la enfermedad clínica en EAE.

La interacción entre B7 y CD28 es una de las diversas rutas de señalización coestimulantes que parecen ser suficientes para desencadenar la maduración y proliferación de células T antigénicamente específicas. La falta de coestimulación, y la concomitante insuficiencia en la producción de IL-2, evitan la subsiguiente proliferación de las células T y provocan un estado de falta de reactividad denominado "anergia". Diversos virus y tumores pueden bloquear la activación y proliferación de células T, lo que conduce a una actividad insuficiente o una falta de reactividad del sistema inmune del huésped frente a las células infectadas o transformadas. Entre las diversas alteraciones posibles de células T, la anergia puede ser al menos parcialmente responsable del fracaso del huésped a la hora de eliminar las células patógenas o tumorigénicas.

El uso de la proteína B7 para mediar en la inmunidad antitumoral ha sido descrito por Chen et al., Cell 71: 1093-1102 (1992), y por Townsend y Allison, Science 259: 368 (1993). Schwartz, Cell 71: 1065 (1992), ha revisado el papel de CD28, CTLA-4 y B7 en la producción de IL-2 y en inmunoterapia. Harding et al., Nature 356: 607-609 (1994), han demostrado que la señalización mediada por CD28 coestimula células T murinas y evita la inducción de anergia en clones de células T. Véanse también las Patentes de EE.UU. números 5.434.131, 5.770.197 y 5.773.253, y las Solicitudes de Patente Internacional números WO 93/00431, WO 95/01994, WO 95/03408, WO 95/24217 y WO 95/33770.

A partir de lo precedente, resultó evidente que las células T requerían dos tipos de señales de la célula presentadora de antígeno (APC) para la activación y la subsiguiente diferenciación a la función efectora. En primer lugar, hay unas señales antigénicamente específicas generadas por interacciones entre el TCR de la célula T y péptidos que presentan moléculas del MHC en la APC. En segundo lugar, hay una señal antigénicamente independiente que es mediada por la interacción de CD28 con miembros de la familia de B7 [B7-1 (CD80) o B7-2 (CD86)]. Exactamente, cuando CTLA-4 se mete en el entorno de sensibilidad inmune, es inicialmente evasiva. El CTLA-4 murino fue identificado y clonado por vez primera por Brunet et al., Nature 328: 267-270 (1987), como parte de una búsqueda de moléculas que se expresan preferentemente en linfocitos T citotóxicos. El CTLA-4 humano fue identificado y clonado poco después por Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18: 1901-1905 (1988). Las moléculas de CTLA-4 murinas y humanas poseen una homología secuencial global de aproximadamente 76% y sus dominios citoplásmicos se acercan a una identidad secuencial completa [Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18: 1901-1905 (1988)]. El CTLA-4 es un miembro de la superfamilia inmunoglobulínica (Ig) de proteínas. La superfamilia Ig es un grupo de proteínas que comparten rasgos estructurales esenciales de un dominio variable (V) o constante (C) de moléculas Ig. Los miembros de la superfamilia Ig incluyen, pero no se limitan a, las propias inmunoglobulinas, moléculas de las clases del complejo principal de histocompatibilidad (MHC; del inglés, major histocompatibility complex) (es decir, las clases I y II del MHC), y moléculas de TCR.

En 1991, Linsley et al., J. Exp. Med. 174: 561-569 (1991), propusieron que CTLA-4 era un segundo receptor de B7. Similarmente, Harper et al., J. Immunol. 147: 1037-44 (1991), demostraron que las moléculas de CTLA-4 y CD28 están íntimamente relacionadas, tanto en ratón como en ser humano, en cuanto a su secuencia, expresión de mensajes, estructura génica y posición cromosómica. Véase también Balzano et al., Int. J. Cancer Suppl. 7: 28-32 (1992). Surgió otra evidencia de este tipo a través de estudios funcionales. Por ejemplo, Lenschow et al., Science 257: 789-792 (1992), demostraron que CTLA-4-Ig provocaba una supervivencia de larga duración de injertos de islotes pancreáticos. Freeman et al., Science 262: 907-909 (1993), examinaron el papel de CTLA-4 en ratones deficientes en B7. Lenschow et al., P.N.A.S. 90: 11.054-11.058 (1993), describieron un examen de los ligandos de CTLA-4. Linsley et al., Science 257: 792-795 (1992), describen la inmunosupresión in vivo por una forma soluble de CTLA-4. Linsley et al., J. Exp. Med. 176: 1595-604 (1992), prepararon anticuerpos que se unían a CTLA-4 y no presentaban reactividad cruzada con CD28, y concluyeron que CTLA-4 se coexpresa con CD28 en linfocitos T activados y regula cooperativamente la adhesión y activación de células T por B7. Kuchroo et al., Cell 80: 707-18 (1995), demostraron que las moléculas coestimulantes B7-1 y B7-2 activaban diferencialmente las rutas...

1. Un anticuerpo monoclonal humano que se une a CTLA-4, o un fragmento ligante de antígenos del mismo, en que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 9 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a la misma, y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 22 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a la misma, anticuerpo o fragmento que tiene las propiedades siguientes:

2. El anticuerpo o el fragmento ligante de antígenos del mismo de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 11.2.1, como se muestra en la Figura 2.

3. El anticuerpo o fragmento ligante de antígenos de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en que la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 del anticuerpo 11.2.1, como se muestra en la Figura 5.

4. El anticuerpo o el fragmento ligante de antígenos del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicación 1 a 3, en que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos del anticuerpo 11.2.1, como se muestra en la Figura 2.

5. El anticuerpo o fragmento ligante de antígenos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicación 1 a 4, en que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 22.

6. Un anticuerpo monoclonal humano que se une a CTLA-4, en que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos del anticuerpo 11.2.1, como se muestra en la Figura 2, y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos del anticuerpo 11.2.1, como se muestra en la Figura 5.

7. Un anticuerpo monoclonal humano que se une a CTLA-4, en que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 70 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 71.

8. Un anticuerpo monoclonal humano que se une a CTLA-4, o un fragmento ligante de antígenos del mismo, en que la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 5 y la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 18.

9. Un anticuerpo monoclonal humano que se une a CTLA-4, o un fragmento ligante de antígenos del mismo, en que la cadena pesada de dicho anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 10 y la cadena ligera de dicho anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 23.

10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento ligante de antígenos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Una línea celular que produce el anticuerpo o el fragmento ligante de antígenos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9.

12. La línea celular de la Reivindicación 11, que es una línea celular de mamífero.

13. La línea celular de la Reivindicación 12, que es una línea celular CHO o una línea celular NSO.

14. Un ácido nucleico que codifica la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo o fragmento ligante de antígenos que se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9.

15. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento ligante de antígenos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para tratar el cáncer.

16. Un método para la producción del anticuerpo humano anti-CTLA-4 o el fragmento ligante de antígenos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9, que comprende hacer que se exprese dicho anticuerpo o dicho fragmento ligante de antígenos en una línea celular huésped y recuperar dicho anticuerpo o dicho fragmento ligante de antígenos.

17. El método de acuerdo con la Reivindicación 16, en que dicha línea celular huésped es una línea celular de mamífero.

18. El método de acuerdo con la Reivindicación 17, en que dicha línea celular de mamífero es una línea celular CHO o una línea celular NSO.

19. El anticuerpo o fragmento ligante de antígenos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9, para uso en el tratamiento del cáncer.