Anticuerpo triespecífico recombinante monocatenario lineal (scTsAb) construido mediante la fusión de un fragmento de anticuerpo monocatenario anti-antígeno carcinoembrionario (CEA) de la región variable (scFv),

un péptido de unión Fc, un fragmento de anticuerpo monocatenario anti-CD3 de la región variable (scFv), un péptido de unión de albúmina de suero humano (HSA), y un anticuerpo anti-CD28 de un único dominio (VH) en tándem

Anticuerpo triespecífico anti-CEA, anti-CD3 y anti-CD28 recombinante monocatenario manipulado genéticamente.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de un anticuerpo manipulado genéticamente recombinante, más concretamente un anticuerpo triespecífico anti-CEA/CD3/CD28 recombinante monocatenario lineal (scTsAb). Asimismo, la presente invención se refiere a una secuencia de ADN codificante de dicho scTsAbs, a plásmidos que contienen dichas secuencias y a células huésped que contienen dichos plásmidos.

Antecedentes de la invención

La activación de los linfocitos T requiere dos tipos de señales in vivo: 1) la interacción entre el complejo MHC/péptido antígeno sobre las APC (células presentadoras de antígenos) y el complejo TCR/CD3 sobre los linfocitos T proporciona la primera señal, y 2) la interacción entre el receptor coestimulador sobre las APC y la molécula coestimuladora sobre los linfocitos T proporciona la segunda señal, una señal coestimuladora. Se acepta de manera general que los linfocitos T no puede activar por completo en presencia de únicamente la primera señal (Baxter y Hodgkin 2002; Bernard, Lamy et al., 2002).

Existen dos tipos de linfocitos T, incluyendo los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las células T ayudantes (TH). Los CTL son las células efectoras principales en la respuesta inmunológica celular, mientras que las TH participan indirectamente en la respuesta inmunológica celular mediante la secreción de citoquinas (tales como interleuquina-2 (IL-2)). Debido a que la inmunidad tumoral es principalmente celular, el diseño de fármacos antitumorales para activar específicamente las CTL resulta de gran importancia en la inmunoterapia tumoral (Foss, 2002).

En la práctica, se han diseñado algunos anticuerpos biespecíficos anti-TAA/CD3 recombinantes (BsAbs) para proporcionar la primera señal para la activación de las CTL y el redireccionamiento de los CTLs activados circundantes a las células tumorales para la eliminación específicamente de las mismas. De entre ellos algunos han sido utilizados clínicamente (Daniel, Kroidl et al., 1998; Holliger, Manzke et al., 1999; Loffler, Kufer et al., 2000; Manzke, Tesch et al., 2001; Manzke, Tesch et al., 2001; Dreier, Lorenczewski et al., 2002; Fang M., 2002; Dreier, Baeuerle et al., 2003; Loffler, Gruen et al., 2003; Fang, Zhao et al., 2004). Se ha demostrado que activan los linfocitos T específicamente e inducen una citolisis específica tumoral evidente. Sin embargo, la mayoría de ellos no era capaz de activar los linfocitos T completamente y en ocasiones resultaba en la activación de la muerte celular inducida (AICD) de los linfocitos T (Daniel, Kroidl et al., 1998).

Para superar los defectos anteriormente indicados, se diseñó otro tipo de BsAb, el BsAb anti-TAA/CD28. Acompañando al BsAb anti-TAA/CD3, se proporciona a los CTLs señales activadoras dobles, induciendo una citolisis específica de tumor más eficiente. Sin embargo, existen varias desventajas en la utilización combinatoria de dos BsAbs. Entre ellas se incluyen la duplicación de las etapas de expresión y purificación, el incremento consecuente del coste de producción y el emparejamiento de dos BsAbs en la medicación clínica. Un anticuerpo triespecífico (TsAb) con tres especificidades de unión (TAA, CD3 y CD28) podría sustituir los dos BsAbs anteriormente indicados en la provisión de señales activadoras dobles (Jung, Brandl et al., 2001; Kodama, Suzuki et al., 2002) y ser superior a ellas en la expresión, purificación y medicación clínica.

En la actualidad existen tres tipos de TsAb. Entre ellos se incluyen: 1) el TsAb conjugado químicamente (Jung, Freimann et al., 1991; Tutt, Stevenson et al., 1991; French, 1998; Wong, Vakis et al., 2000), 2) el TsAb polimérico recombinante (Atwell, Breheney et al., 1999; Dolezal, Pearce et al., 2000; Schoonjans, Willems et al., 2000; Schoonjans, Willems et al., 2000; Kortt, Dolezal et al., 2001; Schoonjans, Willems et al., 2001; Willems, Leoen et al., 2003), y 3) el TsAb recombinante monocatenario (scTsAb) (Li-ping, Ju-long et al., 2003). El tercer tipo de TsAb se cree que resulta superior a los demás debido a la simplicidad de construcción, expresión y purificación. Debido a que el antígeno carcinoembrionario (CEA) es un TAA de amplio espectro (Ganjei, Nadji et al., 1988; Horie, Miura et al., 1996; Kuo, Tsai et al., 1996; Feil, Wechsel et al., 1996; Kammerer, Thanner et al., 2003; Shang-zhi, Chang-cheng et al., 2004), el scTsAb que contiene un anticuerpo anti-CEA puede utilizarse para prevenir o curar diversos tumores a nivel clínico. El documento EP nº 1 378 520 da a conocer un anticuerpo triespecífico TAA/CD3/CD28 de cadena cíclica.

Descripción resumida de la invención

La introducción de un anticuerpo anti-CEA en un scTsAb anti-CEA/CD3/CD28 en la presente invención proporciona un modo conveniente para distinguir las células tumorales de las células normales in vivo, y para evitar o reducir la eliminación no específica por parte de los linfocitos T activados.

Otro aspecto de la presente invención es que CEA se expresa ampliamente en muchas células tumorales, y también resultara en el futuro ampliamente aplicable para curar o prevenir diferentes tumores.

Todavía otro aspecto de la presente invención es que proporciona un método para construir el scTsAb.

La secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 1) de un fragmento monocatenario anti-CEA murino de una región variable contenida en el scTsAb de CEA se indica a continuación:

La secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 2) del fragmento monocatenario anti-CD3 de la región variable contenida en el scTsAb de CEA se indica a continuación:

(Secuencia pasa a página siguiente)

La secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID nº 3) del scTsAb de CEA se indica a continuación:

La secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 4) del scTsAb de CEA se indica a continuación:

Otro aspecto de la presente invención es que proporciona un vector para expresar el scTsAb de CEA: CEA-scTsAb/pTRI.

Sin embargo, en el contexto de la presente invención, otros aspectos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes para el experto ordinario en una materia afín, especialmente basándose en lo dado a conocer en la parte de "Ejemplos".

Breve descripción de los dibujos

Se entenderá que los dibujos pretenden proporcionar ayuda a la comprensión de la presente invención, y que no se apartan del espíritu y alcance de la misma.

Fig. 1. Diagrama del procedimiento para construir un marco multi-clonación de ADN con una PCR solapante. Los números de referencia 2 a 11 representan diferentes fragmentos sintéticos de ácidos nucleicos poliméricos. Los símbolos "A, B, C, D, E, I, II, III, IV, ARRIBA, ABAJO" representan los productos semiacabados de las construcciones. El símbolo "COMPLETO" representa el producto final.

Fig. 2. Detección de los productos de PCR solapante mediante electroforesis en gel de agarosa. Carril 1: producto de la PCR solapante; carril 2: marcador de ADN DL2000 (Dalian Takara Biotech.).

Fig. 3. Secuencia del marco de multi-clonación de ADN.

Fig. 4. Procedimiento para construir el scTsAb de CAA.

Fig. 5. Mapas diagramáticos de vectores para construir y expresar el scTsAb de CEA.

Fig. 6. Identificación del procedimiento de construcción mediante electroforesis en gel de agarosa. Carril 1: producto de PCR amplificado a partir del vector vacío pTRI; carril 2: producto de PCR amplificado a partir del vector CD28 V_H/pTRI, carril 3: producto de PCR amplificado a partir del vector CD3scFv/CD28 V_H/pTRI, carril 4: producto de PCR amplificado a partir del vector CEA-scTsAb/pTRI,...

1. Anticuerpo triespecífico recombinante monocatenario lineal (scTsAb) construido mediante la fusión de un fragmento de anticuerpo monocatenario anti-antígeno carcinoembrionario (CEA) de la región variable (scFv), un péptido de unión Fc, un fragmento de anticuerpo monocatenario anti-CD3 de la región variable (scFv), un péptido de unión de albúmina de suero humano (HSA), y un anticuerpo anti-CD28 de un único dominio (VH) en tándem.

2. Anticuerpo scTsAb según la reivindicación 1, en el que se fusionan una etiqueta c-myc y/o una etiqueta de histidinas al extremo C-terminal del mismo.

3. Anticuerpo scTsAb según la reivindicación 1, en el que dicho scFv anti-CEA comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1.

4. Anticuerpo scTsAb según la reivindicación 1, en el que dicho scFv anti-CD3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2.

5. Anticuerpo scTsAb según la reivindicación 1, en el que dicho scTsAb comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 4.

6. Secuencia de ADN codificante del scTsAb según la reivindicación 5, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 3.

7. Vector de expresión que comprende la secuencia de ADN según la reivindicación 6.

8. Vector de expresión según la reivindicación 7, en el que dicho vector de expresión se construye mediante clonación de la secuencia de ADN de un anticuerpo anti-CEA triespecífico monocatenario (scTsAb de CEA) en pTRI.

9. Célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 7 ó 8.

10. Célula huésped según la reivindicación 9, en la que dicha célula huésped es E. coli.