Virión que comprende un ARN de vector VIB producido por la expresión de una construcción de ADN de vector VIB mínimo,

comprendiendo dicha construcción de vector:

- un promotor operativamente vinculado a una primera región VIB R;

- un elemento VIB U5 vinculado a dicha primera región VIB R;

- una secuencia de empaquetado VIB;

- un transgen, y

- un elemento VIB U3 vinculado a una segunda región VIB R;

en el que el promotor inicia la transcripción de ARN del vector

Vectores basados en virus de inmunodeficiencia bovina (VIB).

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere generalmente a la utilización de virus recombinantes como vectores, y más específicamente a construcciones de vector basadas en el virus de la inmunodeficiencia bovina recombinante (VIB) capaz de expresar una proteína deseada en las células objetivo.

El uso de vectores virales recombinantes en una variedad de aplicaciones que incluye, por ejemplo, la terapia génica requiere que el virus no sea capaz de replicarse en las células objetivo para evitar la posibilidad una proliferación de virus o celular incontrolable. Además de la seguridad, el sistema de virus vector recombinante debe ser eficiente y preciso.

Los retrovirus se han utilizado como vectores para mediar en la transferencia de genes en las células eucariotas. Los retrovirus son virus de ARN que incluyen las subfamilias lentivirus, spumavirus y oncovirus. Estos virus se pueden replicar e integrar en un genoma de la célula huésped a través de un ADN intermediario, generalmente llamado provirus.

Los vectores virales son generalmente construidos de tal manera que la mayoría de los genes virales se suprimirá y se sustituirá por un gen de interés. Con más frecuencia el gen de interés se transcribe bajo el control de las secuencias reguladoras virales dentro de la repetición terminal larga (LTR). Por otra parte, el gen de interés puede materializarse, bajo la regulación de su propio promotor interno. Los genes que han sido suprimidas del vector son generalmente proporcionados por una o varias construcciones auxiliares o de empaquetado en una línea celular de empaquetado (Bender et al., J. Virol. 61:1639-1649 (1987) y Miller et al. Biotechniques, 7:980-990 (1989)). Véase también Markowitz et al., J. Virol. 62:1120-1124 (1988) donde las porciones complementarias de la construcción auxiliar fueron divididas en dos construcciones separadas. La línea celular empaquetada puede ser transfectada con el vector retroviral, produciendo vectores de ARN que se empaquetan en las partículas del virus. Estas partículas liberadas del virus son de replicación defectuosa y pueden ser utilizadas para entregar el vector retroviral portador de un gen heterólogo de interés a las células objetivo.

Para aumentar la seguridad, la eficiencia y la exactitud de los sistemas de vectores recombinantes, se han construido diversos sistemas recombinantes mejorados. Un tipo de mejora incluye hacer líneas celulares de empaquetado más seguras que se generan por las eliminaciones en la repetición de terminal largo 3' (LTR). Otras mejoras incluyen el aumento de la gama de huéspedes mediante la sustitución de un gen env viral con la de otro gen env viral, creando así una línea de producción híbrida que genera virus auxiliares pseudotipados. Más concretamente, al HIV se ha dado una gama extendida de la célula huésped mediante pseudotipado con los virus no relacionados VSV y VHS (Zhu et al., J. SIDA, 3:215-219 (1990) y Naldini et al., Science, 272:263-267, (1996)). Otras mejoras han sido hechas mediante el uso de un mínimo de regiones de codificación virales en el vector. Además, la mayoría de líneas celulares de empaquetado que se utilizan actualmente han sido transfectadas con plásmidos separados, cada uno conteniendo una de las secuencias de codificación necesarias para que sean necesarios eventos múltiples antes de que se pueda producir la recombinación de virus de replicación competente. WO99/15621 se refiere a los vectores lentivirus no primates, particularmente vectores basados en FIV.

A diferencia de los vectores derivados de oncovirus, los lentivirus pueden infectar a células que no se dividen. Esta propiedad es especialmente útil para la terapia génica in vivo.

El VIB por lo general no infecta a las células humanas y, por tanto, el uso de la columna vertebral genómica VIB en los vectores de la presente invención supera las dificultades de las líneas anteriores de empaquetado de la célula y dispone, además, otras ventajas relacionadas para la construcción de un vector mejorado.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un virión que comprende un ARN de un vector VIB producido por la expresión de una construcción mínima de ADN vector de VIB, comprendiendo dicha construcción de vector:

en el que el promotor inicia la transcripción de ARN del vector.

Una o más secuencias en el elemento U3 pueden ser mutadas o suprimidas con el fin de disminuir o eliminar la transcripción mediada por U3 de todos los genes siguientes y el elemento U3 que opcionalmente contiene además una secuencia que mejora la poliadenilación.

El transgen puede estar operativamente vinculado a un promotor interno, tal como un promotor de CMV, un promotor PGK, o un promotor de la MND.

El virión puede comprender un tracto de polipurina 3', situado inmediatamente antes (es decir, 5') del elemento la U3 3'.

El virión puede comprender además una zona polipurina central (cPPT) y/o un elemento de transporte del ARN, tal como un elemento de respuesta VIB rev (RRE) o un elemento de transporte constitutivo (CTE).

En el virión de la invención cualquier codón de inicio en la secuencia de empaquetado puede ser eliminado por supresión o mutación.

También se prevé que el uso del virión de la invención para la transducción de una célula de mamífero in vitro.

También se proporcionará, cuando dicho transgen del virión codifica una proteína terapéutica, el virión para su uso en el tratamiento de un ser humano.

En otro aspecto, se proporciona un sistema para la producción de un virión, comprendiendo dicho sistema:

a) una construcción de ADN que codifica el ARN vector VIB de cualquiera de la invención;

b) una construcción de empaquetado VIB que comprende un promotor operativamente vinculado a una secuencia de codificación VIB gag/pol y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia de codificación gag/pol;

c) una construcción de una expresión que codifica una proteína de superficie viral.

En dicho sistema de la proteína de superficie viral puede ser una proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular G (VSV-G).

Se describe a continuación una construcción de vector de combinación VIB que comprende un segmento de ADN de un genoma VIB, donde el segmento de ADN cuenta con un gen gag, un gen pol, un segmento del gen env y una secuencia de empaquetado VIB para empaquetar ARN VIB en los viriones, un promotor operativamente vinculado al segmento de ADN y un transgen operativamente vinculado al promotor donde el transgen se inserta en el segmento del gen env. En una modalidad preferida, una parte del gen interior env es suprimida, y el transgen se inserta en el vacío creado por la eliminación. En realizaciones adicionales, el segmento de ADN puede incluir uno o más de los siguientes genes vif, vpw, vpy, rev, y tat, en particular tat y rev.

Se describe a continuación un vector VIB que comprende un segmento de ADN de un genoma VIB, una secuencia de empaquetado para empaquetar el ARN en los viriones; un primer promotor operativamente vinculado al segmento de ADN y un transgen operativamente vinculado a un segundo promotor. En una realización preferida, la secuencia de empaquetado es una secuencia de empaquetado VIB y el promotor es un promotor LTR o un promotor citomegalovirus (CMV). En una realización preferida adicional, el segmento de ADN también comprende una porción de un gen gag. En otra realización, el vector incluye un elemento de respuesta rev (RRE).

Se describe a continuación una construcción de empaquetado VIB que comprende un fragmento de la secuencia de ADN VIB que incluye al menos un gen gag o pol de VIB, y un promotor operativamente vinculado al fragmento de ADN VIB. Preferiblemente, una secuencia de poliadenilación está situada a continuación del...

1. Virión que comprende un ARN de vector VIB producido por la expresión de una construcción de ADN de vector VIB mínimo, comprendiendo dicha construcción de vector:

en el que el promotor inicia la transcripción de ARN del vector.

2. Virión según la reivindicación 1, en el que una o más secuencias en el elemento U3 están mutadas o eliminadas para disminuir o eliminar la transcripción mediada por U3 de todos los genes posteriores.

3. Virión según la reivindicación 2, en el que dicho elemento U3 también contiene una secuencia que mejora la poliadenilación.

4. Virión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el transgen está operativamente vinculado a un promotor interno.

5. Virión según la reivindicación 4, en el que el promotor interno es un promotor CMV, un promotor PGK, o un promotor MND.

6. Virión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un tracto de polipurina 3', situado inmediatamente antes (es decir, 5') del elemento U3 3'.

7. Virión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un tracto de polipurina central (cPPT).

8. Virión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que también comprende elementos de transporte de ARN.

9. Virión según la reivindicación 8, en el que el elemento de transporte de ARN es un elemento de respuesta rev VIB (RRE) o un elemento de transporte constitutivo (CTE).

10. Virión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cualquiera de los codones de inicio en la secuencia de empaquetado se elimina por eliminación o mutación.

11. Utilización del virión según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para la transducción de una célula de mamífero in vitro.

12. Virión según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el transgen codifica una proteína terapéutica, para su utilización en el tratamiento de un ser humano.

13. Sistema para la producción de un virión, comprendiendo dicho sistema:

a) una construcción de ADN que codifica el ARN de vector VIB según cualquiera de las reivindicaciones 1-10;

b) una construcción de empaquetado VIB que comprende un promotor operativamente vinculado a una secuencia de codificación VIB gag/pol y una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la secuencia de codificación gag/pol;

c) una construcción de expresión que codifica una proteína de superficie viral.

14. Sistema según la reivindicación 13, en el que la proteína de superficie viral es una proteína de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular G (VSV-G).