USO DE SUPERFICIES DE CONTROL PARA DETECTAR MUESTRAS QUE INTERFIEREN EN UN PROCESO DE IDENTIFICACION.

Método de detección de un analito mediante su fijación específica a un receptor de fase sólida,

revelando además las interferencias ocasionadas por fijaciones inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito mediante el uso de una fase sólida con, al menos, una superficie de ensayo delimitada que lleva un receptor de fase sólida con un sitio de unión al receptor específico del analito, de modo que la fase sólida incluye asimismo, al menos, una superficie de control delimitada, para detectar interferencias causadas por fijaciones inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito, y el receptor de fase sólida con el sitio de unión al receptor específico del analito ha sido aplicado con el empleo de una solución de carga y la superficie de control forma parte de la superficie de ensayo y lleva reactivos de la solución de carga, pero no el sitio de unión al receptor específico del analito

Uso de superficies de control para detectar muestras que interfieren en un proceso de identificación.

La presente invención se refiere a una fase sólida que lleva al menos una superficie de ensayo para detectar un analito y también comprende, al menos, una superficie de control para detectar interferencias. Además la presente invención se refiere a un proceso para detectar uno o más analitos, usando una fase sólida conforme a la presente invención, que permite distinguir reacciones perturbadoras y, dado el caso, corregirlas.

Al detectar un analito mediante ensayos de fijación, en la reacción de identificación de algunas muestras aparecen interferencias que falsean los valores de la medición. Este fenómeno se designa casi siempre efecto matriz de la muestra. Generalmente en los formatos de ensayo usuales hasta la fecha no se puede poner de manifiesto una interferencia. Mediante una compleja optimización de la fase acuosa, de los tampones y del reactivo de identificación se intenta suprimir totalmente el efecto matriz de las diversas muestras o mantenerlo lo más bajo posible, pero eliminar las perturbaciones de los procesos de detección es difícil y costoso. Tampoco hay que descartar que en determinadas muestras, a pesar de la optimización del ensayo, no se pueda lograr una eliminación suficiente de las perturbaciones, por ser desgraciadamente imposible la supresión total del efecto matriz. Además durante el desarrollo del proceso de ensayo pueden surgir nuevas interferencias desconocidas, que también dan lugar a resultados falsos. Por lo tanto existe el problema de que en los métodos de detección se pueden obtener resultados de ensayo falsos, sin que el usuario lo reconozca. Esta circunstancia es especialmente trágica en el caso de los ensayos cualitativos de detección de enfermedades infecciosas. Así, por ejemplo, una muestra falsamente positiva debida a problemas de matriz en una prueba de VIH tiene consecuencias considerables.

La patente US-A-4,558,013 describe una tira de ensayo que junto a zonas de ensayo recubiertas con reactivos específicos tiene una zona de control negativa no delimitada, sin recubrir. El valor medido en la zona de ensayo se corrige por substracción de la fijación inespecífica en la zona de control. De todos modos este procedimiento solo permite corregir en parte las interferencias, pues la fijación inespecífica de componentes perturbadores a la zona de ensayo casi siempre se diferencia considerablemente de la fijación inespecífica de componentes perturbadores a la zona de control.

La patente US-A-5,35 6,7 85 describe una fase sólida con varias superficies de ensayo que llevan respectivamente distintas cantidades de un receptor en fase sólida para detectar un analito. La fase sólida contiene además una superficie de referencia que da una señal detectable de intensidad conocida con el reactivo de ensayo. No se revela ninguna superficie de control para determinar interacciones inespecíficas entre la muestra y la fase sólida.

La patente US-A-4,916,05 6 (Brown III y otros) describe una fase sólida para la determinación cualitativa o cuantitativa de un analito - sobre todo de un antígeno, anticuerpo o segmento de ADN - en una muestra. Además de una superficie de ensayo, la fase sólida comprende una superficie de referencia que da una señal positiva en el ensayo, así como una zona de control negativa, no delimitada, que contiene la superficie de referencia positiva y la superficie de ensayo. Una desventaja de este dispositivo es que la superficie de la zona de control no recubierta difiere demasiado de la superficie de ensayo para lograr una corrección efectiva de las perturbaciones.

Por tanto un objetivo de la presente invención consistía en aportar dispositivos y métodos para la determinación de un analito, que permitieran una indicación directa de la presencia y, dado el caso, del tipo de interferencias, para poder incluirlas en la valoración de los resultados de ensayo.

Según la presente invención dicho objetivo se resuelve con un método de detección de un analito mediante su fijación específica a un receptor de fase sólida, revelando además las interferencias ocasionadas por fijaciones inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito mediante el uso de una fase sólida con, al menos, una superficie de ensayo delimitada que lleva un receptor de fase sólida con un sitio de unión al receptor específico del analito, de modo que la fase sólida incluye asimismo, al menos, una superficie de control delimitada, para detectar interferencias causadas por fijaciones inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito, la cual forma parte de la superficie de ensayo y lleva reactivos de la solución de carga, pero no el sitio de unión al receptor específico del analito. La presente invención se refiere igualmente a una fase sólida con, al menos, una superficie de ensayo definida que lleva un receptor de fase sólida para la detección de un analito en una muestra mediante su fijación específica a un sitio de unión al receptor, específico del analito, del receptor de fase sólida, la cual se caracteriza por comprender además, como mínimo, una superficie de control delimitada para detectar interferencias producidas por fijaciones inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito, de modo que la superficie de control forma parte de la superficie de ensayo y lleva reactivos de la solución de carga, pero no el sitio de unión al receptor específico del analito.

Por "superficies de ensayo delimitadas" sobre una fase sólida hay que entender que las superficies de ensayo abarcan zonas definidas de la fase sólida, distanciadas preferiblemente de otras superficies de ensayo mediante zonas inertes. Las superficies de ensayo delimitadas tienen preferiblemente un diámetro de 10 µm hasta 1 cm y con especial preferencia de 10 µm hasta 5 mm. Sobre todo se prefieren superficies de ensayo miniaturizadas, con un diámetro de 10 µm hasta 2 mm. Se prefieren las fases sólidas con varias superficies de ensayo, también conocidas como sistemas matriciales. Estos sistemas están descritos p.ej. por Ekins y Chu (Clin. Chem. 37 (1995), 1955-1967), y en las patentes US nº 5,432,099, 5,516,635 y 5,126,276. Los sistemas matriciales tienen la ventaja de que permiten efectuar varias determinaciones simultáneas de analitos y controles en una muestra. El empleo de superficies de control para detectar fijaciones inespecíficas y/o muestras perturbadoras puede mejorar mucho la seguridad de los resultados, precisamente en sistemas matriciales de ensayo miniaturizados.

Aquí es de especial interés la captación de interferencias y fijaciones inespecíficas en los ensayos cualitativos, sobre todo en aquellos con gran exigencia de especificidad, como en el caso de las pruebas de infección (p.ej. por VIH). La indicación de una interferencia y la corrección del valor medido pueden disminuir claramente los resultados falsamente positivos, mejorando enormemente la especificidad.

La fase sólida según la presente invención es cualquier soporte habitual en procesos de detección, preferiblemente un soporte no poroso, p.ej. un soporte con superficie de plástico, de vidrio, de metal o de óxido metálico. También son adecuados soportes porosos como por ejemplo las tiras de ensayo. Sobre este soporte se han dispuesto zonas discretas (superficies de ensayo). Sobre estas superficies de ensayo hay receptores de fase sólida inmovilizados. La inmovilización de los receptores de fase sólida se realiza según métodos conocidos, p.ej. por fijación directa adsortiva, por unión covalente o por acoplamiento mediante pares de fijación de gran afinidad, p.ej. estreptavidina/biotina, antígeno/anticuerpo o azúcar/lectina. La presencia y/o cantidad de analito en una muestra puede determinarse por fijación específica de componentes del medio detector, p.ej. del analito o de un análogo del analito objeto de detección, al receptor de fase sólida.

En el proceso de la presente invención, la detección del analito y de la presencia de reacciones perturbadoras tiene lugar de manera conocida, usando grupos marcadores adecuados, p.ej. grupos marcadores fluorescentes. Como alternativa - en fases sólidas apropiadas - la interacción de los componentes del medio detector con las superficies de ensayo y de control también se puede detectar determinando el espesor de capa de la respectiva superficie, p.ej. mediante espectroscopia de resonancia de plasmones.

En los sistemas matriciales - en los cuales se detectan simultáneamente varios analitos de una muestra...

1. Método de detección de un analito mediante su fijación específica a un receptor de fase sólida, revelando además las interferencias ocasionadas por fijaciones inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito mediante el uso de una fase sólida con, al menos, una superficie de ensayo delimitada que lleva un receptor de fase sólida con un sitio de unión al receptor específico del analito, de modo que la fase sólida incluye asimismo, al menos, una superficie de control delimitada, para detectar interferencias causadas por fijaciones inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito, y el receptor de fase sólida con el sitio de unión al receptor específico del analito ha sido aplicado con el empleo de una solución de carga y la superficie de control forma parte de la superficie de ensayo y lleva reactivos de la solución de carga, pero no el sitio de unión al receptor específico del analito.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque las superficies de control se usan para la corrección cuantitativa de interferencias.

3. Uso de superficies de control delimitadas para detectar interferencias causadas por componentes perturbadores ajenos al analito en un proceso de detección de un analito mediante su fijación específica a un sitio de unión al receptor, específico del analito, de un receptor de fase sólida en una superficie de ensayo delimitada, de modo que el receptor de fase sólida con el sitio de unión al receptor específico del analito ha sido aplicado con el empleo de una solución de carga y la superficie de control forma parte de la superficie de ensayo y lleva reactivos de la solución de carga, pero no el sitio de unión al receptor específico del analito.

4. Fase sólida con al menos una superficie de ensayo delimitada, que contiene un receptor de fase sólida para detectar un analito en una muestra por fijación específica del mismo a un sitio de unión al receptor, específico del analito, del receptor de fase sólida, caracterizado porque además incluye, al menos, una superficie de control delimitada para detectar interferencias producidas por fijaciones inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito, de modo que el receptor de fase sólida con el sitio de unión al receptor específico del analito ha sido aplicado con el empleo de una solución de carga y la superficie de control forma parte de la superficie de ensayo y lleva reactivos de la solución de carga, pero no el sitio de unión al receptor específico del analito.

5. Fase sólida según la reivindicación 4, caracterizada porque lleva varias superficies de ensayo para la detección simultánea de varios analitos en una muestra.

6. Fase sólida según una de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizada porque lleva al menos una superficie de control para detectar interferencias producidas por una fijación, no específica del analito, de componentes del medio detector a la superficie de ensayo.

7. Fase sólida según una de las reivindicaciones anteriores 4 a 6, caracterizada porque comprende al menos una superficie de control para detectar interferencias producidas por una fijación, no específica del analito, de componentes del medio detector al receptor de fase sólida sobre una superficie de ensayo.

8. Fase sólida según la reivindicación 6 o 7, caracterizada porque comprende al menos una superficie de control para detectar interferencias producidas por una fijación, no específica del analito, de componentes del medio detector a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, antígenos o/y ácidos nucleicos inmovilizados sobre una superficie de ensayo.

9. Fase sólida según la reivindicación 7 u 8, caracterizada porque la superficie de control lleva un receptor de fase sólida modificado que difiere de un receptor de fase sólida sobre una superficie de ensayo por la falta de un sitio de unión específico del analito.

10. Fase sólida según la reivindicación 7, 8 o 9, caracterizada porque lleva al menos una superficie de control para detectar interferencias causadas por factores reumáticos.

11. Fase sólida según la reivindicación 7, 8 o 9, caracterizada porque lleva al menos una superficie de control para detectar interferencias causadas por anticuerpos específicos de especies extrañas.

12. Fase sólida según una de las reivindicaciones anteriores 4 a 11, caracterizada porque lleva al menos una superficie de control para detectar interferencias causadas por la fijación inespecífica de componentes del medio detector a sustancias no específicas del analito sobre el soporte de fase sólida.

13. Fase sólida según la reivindicación 12, caracterizada porque incluye al menos una superficie de ensayo con estreptavidina y al menos una superficie de control para detectar interferencias causadas por componentes fijadores de estreptavidina no específicos del analito.

14. Fase sólida según la reivindicación 6, caracterizada porque lleva al menos una superficie de control para detectar el contenido total de IgE.

15. Fase sólida según una de las reivindicaciones 4 a 14, caracterizada porque además lleva, al menos, una superficie de referencia positiva con el analito a determinar.

16. Fase sólida según una de las reivindicaciones 4 a 15, caracterizada porque las superficies de ensayo y las superficies de control tienen un diámetro de 10 µm hasta 1 cm.

17. Uso de una fase sólida según una de las reivindicaciones 1 a 16 para detectar un analito en una muestra.

18. Uso según la reivindicación 17, caracterizado porque la fase sólida comprende varias superficies de ensayo para la detección simultánea de varios analitos.

19. Uso según la reivindicación 17 o 18 en un inmunoensayo.

20. Uso según la reivindicación 17 o 18 en un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos.