PRODUCCION DE FASES SOLIDAS DE CONTORNO NITIDO PARA PRUEBAS DE FIJACION.

Método para aplicar superficies espacialmente delimitadas, que contienen moléculas receptoras,

sobre un soporte sólido no poroso, que comprende las siguientes etapas:

(a) aplicación de una solución de recubrimiento que contiene moléculas receptoras, sobre áreas limitadas del soporte sólido prefijadas,

(b) fijación de las moléculas receptoras en las áreas espacialmente delimitadas,

(c) secado de la disolución de recubrimiento y

(d) aplicación de una solución de recarga -añadiendo a la solución de recubrimiento un retardante de la elución elegido entre sacáridos, polivinilpirrolidona, dextrano, gelatina o derivados de celulosa - que contiene una sustancia bloqueante

Producción de fases sólidas de contorno nítido para pruebas de fijación.

La presente invención se refiere a un método para aplicar un recubrimiento de varias capas sobre un soporte sólido no poroso, a un método para evitar el ensuciamiento de fases sólidas espacialmente definidas, a un método para reducir la unión inespecífica a una fase sólida recubierta con estreptavidina o avidina, así como a fases sólidas preparadas con el método de la presente invención.

Las pruebas de fijación para determinar analitos, como por ejemplo inmunoanálisis, ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, etc., se efectúan a gran escala. La detección de un analito mediante pruebas de fijación puede realizarse con un ensayo de tipo heterogéneo, poniendo en contacto una fase líquida con una fase sólida. La fase sólida comprende superficies de ensayo con moléculas de receptor, a las cuales es capaz de unirse el analito. A continuación se comprueba la fijación del analito, p.ej. mediante un marcaje.

Para que la determinación cualitativa o cuantitativa de un analito resulte fiable es necesario que las superficies de ensayo de las pruebas de fijación puedan prepararse de modo reproducible y con cantidades de moléculas receptoras exactamente definidas. Los diferentes tamaños de las superficies de ensayo, la falta de nitidez de sus bordes, el ensuciamiento de las moléculas receptoras, la distinta densidad de receptor en las superficies de ensayo y los sitios de fijación inespecíficos dan lugar a diferencias de intensidad de la señal detectada y por tanto a imprecisiones en la evaluación de los resultados de ensayo.

Estos problemas tienen mayor repercusión cuanto menor sea la fase sólida y las superficies de ensayo que se hallan sobre ellas. Cuando hay superficies de ensayo individuales cercanas entre sí, con diferentes moléculas de receptor para la detección de distintos analitos, la falta de nitidez de los bordes de dichas superficies o/y el ensuciamiento de las moléculas receptoras puede causar la contaminación de superficies específicas de ensayo con moléculas de receptor dirigidas contra otro analito y por tanto dar falsos resultados. Este problema es especialmente grave en el caso de análisis cualitativos para la detección de enfermedades infecciosas. Así p.ej., una prueba falsamente positiva por ensuciamiento de las moléculas receptoras en un ensayo de HIV tiene serias consecuencias.

Muchos formatos de ensayo se basan en el uso de soportes porosos, como por ejemplo discos de papel u otros materiales porosos. Para dichos formatos de ensayo - como los que se describen en las patentes EP-A-0 427 984 y EP-A-0 063 810 por ejemplo - se forma una capa de receptor sobre un material poroso, aplicando sobre él moléculas receptoras en solución, que son absorbidas por el soporte. La absorción de esta solución produce sobre todo una ampliación de la superficie recubierta, que depende de la microestructura local del material soporte. Por tanto, con este método resulta difícil preparar superficies de ensayo uniformes y reproducibles, sobre todo para formatos de ensayo miniaturizados. Además en estos formatos de ensayo miniaturizados, a base de materiales soporte porosos, la evaluación es difícil. Dado que las superficies de los materiales soporte porosos no son planas ni uniformes, en la mayoría de los casos solo puede lograrse una resolución óptica limitada de las superficies de ensayo.

Por consiguiente, se intentó el empleo de un material soporte con una superficie no porosa, en lugar de material poroso. La patente US-PS-4,5 91,570 describe un dispositivo de inmunoensayos para determinar simultáneamente diversos antígenos mediante una colección de anticuerpos, usando vidrio o plástico como soporte. Con el empleo de este material soporte se puede reducir claramente el tamaño global del formato de ensayo y, por lo tanto, la cantidad necesaria de muestras. De todos modos, en las superficies no porosas, sobre todo en los procesos de ensayo miniaturizados, también hay el problema de ensuciamiento de las moléculas receptoras. El ensuciamiento puede ser debido a una atomización incontrolada de la solución de recubrimiento, es decir, un incremento de superficie cuyo contorno queda uniforme. Además también puede producirse un corrimiento incontrolado de la disolución de recubrimiento aplicada, lo cual genera un contorno irregular. Por último, el ensuciamiento puede causar un desplazamiento de moléculas receptoras fuera de la superficie humectada con la disolución de recubrimiento.

Además Pirrung y otros, Bioconjugate Chemistry, 7(3), 1996, 317-321, describen un método por el cual se fija BSA con un grupo nitrobencilo eliminable mediante luz. Después de fijar BSA a un soporte de vidrio, se puede eliminar por irradiación en determinadas zonas, que luego quedan libres para una fijación de avidina. La subsiguiente adición de una molécula biotinilada permite una unión ortoespecífica de la molécula.

Delamarche y otros, J. Am. Soc., 120, 1998, 500-508, describen la organización, función y fijación de un dispositivo de reactantes químicos espacialmente delimitado sobre un substrato mediante una red microfluida. En general las redes microfluidas trabajan con cantidades de líquidos del orden de µl, que por tanto son adecuadas para aquellas aplicaciones en que se dispone de pequeñas cantidades de reactantes.

Sundarababu y otros, Photochemistry and Photobiology 61(6), 1995, 540-544, describen el revestimiento de chips de silicio con anticuerpos, mediante un acoplamiento inducido por luz.

Ansari y otros, Journal of Immunological Methods, 84, 1985, 117-124, describen el recubrimiento de placas microtítulo de poliestireno con anticuerpos y estudian el efecto de diversas condiciones de almacenamiento de las placas sobre la estabilidad y la fijación de los anticuerpos.

Además, muchas de las moléculas receptoras normalmente empleadas, por ejemplo los receptores de bajo peso molecular, se adsorben mal o de manera poco reproducible sobre soportes sólidos con superficies no porosas. Asimismo, muchas soluciones acuosas de moléculas receptoras - como las que se emplean habitualmente para aplicar moléculas receptoras sobre fases sólidas - contienen un detergente para su estabilización, lo cual impide, al menos en parte, la adsorción de las moléculas receptoras sobre soportes sólidos con superficies no porosas.

Para mejorar la capacidad de fijación de las moléculas receptoras a superficies no porosas se pueden aplicar recubrimientos de varias capas. Pero estos recubrimientos también presentan diferencias de tamaño y falta de nitidez de bordes entre cada una de las superficies de ensayo, lo cual ocasiona grandes problemas durante la valoración, sobre todo en caso de formatos de ensayo miniaturizados.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención era proporcionar un método que permitiera obtener superficies de ensayo de contornos nítidos para pruebas de fijación.

Este objetivo se logra según la presente invención con un método para aplicar superficies espacialmente delimitadas, que contienen moléculas receptoras, sobre un soporte sólido no poroso, que comprende las siguientes etapas:

Conforme a la presente invención, el soporte sólido no poroso se trata primero con un recubrimiento previo, que se puede aplicar totalmente o también por puntos sobre una parte o...

1. Método para aplicar superficies espacialmente delimitadas, que contienen moléculas receptoras, sobre un soporte sólido no poroso, que comprende las siguientes etapas:

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la solución de recubrimiento se aplica formando superficies espacialmente delimitadas, con un diámetro de 10 µm a 10 mm.

3. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se aplican varias superficies espacialmente delimitadas, de tal manera, que al menos dos de ellas presentan moléculas receptoras distintas.

4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la solución de recarga contiene =q 0,5% en peso de una sustancia bloqueante.

5. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la solución de recarga se aplica dentro de un periodo mínimo de tiempo, como máximo de 500 mseg.

6. Método según una de las reivindicaciones precedentes que además comprende un recubrimiento previo con las siguientes etapas

7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la solución de recubrimiento que lleva moléculas receptoras se aplica directamente sobre el soporte sólido no poroso.

8. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la solución de recubrimiento que lleva moléculas receptoras se aplica en forma de microgotitas.

9. Método para evitar el ensuciamiento de fases sólidas espacialmente delimitadas - impidiendo que moléculas receptoras eluidas de dichas fases se fijen de nuevo al aplicar una solución de recarga - que comprende las siguientes etapas:

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque se aplica una solución de recubrimiento que tiene una concentración de moléculas receptoras inferior al 90% de la concentración límite necesaria para cubrir completamente la zona prefijada.

11. Fase sólida que puede obtenerse por un método según una de las reivindicaciones precedentes, la cual se genera aplicando una solución de recubrimiento - que contiene moléculas receptoras - sobre determinadas zonas de un soporte sólido no poroso y a continuación una solución de recarga, de modo que las moléculas receptoras se sitúan en superficies espacialmente delimitadas, caracterizada porque =q 80% de las moléculas receptoras se hallan dentro de las superficies espacialmente delimitadas.

12. Fase sólida según la reivindicación 11, caracterizada porque las zonas prefijadas y espacialmente delimitadas que llevan las moléculas receptoras tienen un diámetro de 10 µm a 10 mm y varían de superficie a superficie menos de un 10%.