Dispositivo de inmunoensayo para medir la troponina I y/o T cardíaca,

que comprende:

un filtro para recibir una muestra de sangre, suero o plasma, en el que dicho filtro comprende troponina C aplicada al mismo;

una cámara de reacción que comprende un reactivo conjugado de anticuerpos secado que comprende un anticuerpo que forma un complejo con la troponina I y/o T cardíaca conjugada a una etiqueta detectable, donde dicha muestra de sangre, suero o plasma pasa desde dicho filtro al interior de dicha cámara de reacción mediante acción capilar;

una zona de captura configurada para inmovilizar, para la detección de la troponina I y/o T cardíaca complejada, al conjugado de anticuerpos, en la que la mezcla de reacción fluye desde dicha cámara de reacción a dicha zona de captura mediante acción capilar

Procedimiento para la mejora de la recuperación de troponina I y T.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un dispositivo para inmunoensayos para mediciones y para troponina T.

Antecedentes de la técnica

El infarto de miocardio es una de las principales causas de muerte en los Estados Unidos. Aproximadamente 5 millones de individuos que experimentan dolor torácico son evaluados cada año en hospitales a lo largo de Estados Unidos, sin embargo, posteriormente se encuentra que menos del 30% de estos individuos han tenido un infarto de miocardio. La diagnosis exacta y rápida de un infarto de miocardio es importante tanto para el paciente que sufre un infarto de miocardio como para el sistema de salud que puede minimizar los costos en los que se incurre identificando rápidamente los individuos que no necesitan tratamiento.

La diagnosis de un infarto de miocardio se realiza normalmente en el departamento de emergencias de un hospital. Un individuo, que tiene síntomas de infarto de miocardio, es tratado de maneras diferentes dependiendo de la evidencia de la afección. Generalmente, se realiza un electrocardiograma para valorar la afección del corazón; sin embargo, aproximadamente el 50% de los pacientes que experimentan un infarto de miocardio tienen un electrocardiograma no diagnóstico. Entonces, el médico se encuentra con un problema de diagnosticar y tratar al paciente sospechoso de tener un infarto de miocardio. De esta manera, la diagnosis y el tratamiento son difíciles para pacientes sospechosos de sufrir un infarto de miocardio que tienen electrocardiogramas no diagnósticos.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha instituido directrices para diagnosticar un infarto de miocardio que exponen que un individuo debe exhibir dos de los tres criterios siguientes: 1) tener dolor torácico o un historial de enfermedad cardíaca; 2) un electrocardiograma diagnóstico; y, 3) creatina quinasa (CK) o isoenzima de creatina quinasa MB (CKMB) elevada. De esta manera, para el 50% de los individuos que se presentan en los hospitales por una sospecha de infarto de miocardio y que tienen un electrocardiograma no diagnóstico, el médico debe depender de los síntomas de dolor torácico y una CK o una CKMB elevada para diagnosticar un infarto de miocardio.

El ensayo de CK o CKMB es realizado generalmente en laboratorios de hospitales usando instrumentación sofisticada. Los ensayos incluyen inmunoensayos y ensayos de enzimas que detectan la actividad o la masa de CK o CKMB presente en las muestras de sangre.

Durante un infarto de miocardio, las células del músculo cardíaco mueren y liberan sus contenidos al torrente sanguíneo. La CKMB es liberad entre dichos componentes celulares. La CKMB se incrementa por encima de un valor nominal normal y puede ser diagnóstico para un infarto de miocardio. La especificidad de CKMB para diagnosticar un infarto de miocardio no es del 100% ya que otra fuente de CKMB en el cuerpo es el músculo esquelético. Debido a que la masa del músculo esquelético en el cuerpo excede con creces la masa del músculo cardíaco, durante la regeneración catabólica normal de las células del músculo esquelético, la concentración de CKMB en la sangre en individuos sanos variará. En general, la concentración de CKMB que puede ser indicativa de un infarto de miocardio es superior a 5-7 ng/ml (Circulation 87, 1542-1550 (1993), Clin. Chem. 39, 1725-1728 (1993)). La concentración de CKMB de individuos que tienen una lesión del músculo esquelético o que han hecho ejercicio se ha informado que se eleva valor superior a 9 ng/ml (Clin. Chem. 38, 2396-2400 (1992)). Por lo tanto, el problema de la especificidad, cuando se usa CKMB como un marcador para un infarto de miocardio, ha provocado la búsqueda para otros marcadores más específicos que son liberados sólo desde el músculo cardíaco dañado.

Se ha demostrado recientemente que la troponina I y la troponina T son más específicos que la CKMB para diagnosticar un infarto de miocardio (Circulation 83, 902-912 (1991), Clin. Chem. 40, 1291-1295 (1994), aunque la troponina T tiene algunas desventajas como marcador debido a que es elevada en pacientes que experimentan enfermedad renal (Clin. Chem. 41, 312-317 (1995)). El uso de troponina I como un marcador diagnóstico para un infarto de miocardio parece cumplir también muchos de los requerimientos clínicos (Clin. Chem. 40, 1291-1295 (1994), Clin. Chem. 41, 312-317 (1995)).

El documento WO 96/33415 divulga procedimientos para mejorar la recuperación de troponina I y/o troponina T añadiendo troponina C a una muestra que se supone que comprende troponina I y/ troponina T. La unión de troponina I y/o troponina T de, por ejemplo, membranas, filtros o recipientes es considerablemente reducida por la formación de complejos con troponina C, que tienen una tendencia reducida a ser absorbidas en dichas superficies comparadas con los monómeros de troponina respectivos.

El documento WO 93/24231 divulga dispositivos de ensayo que comprenden al menos dos superficies opuestas dispuestas separadas por una distancia capilar, al menos una de las cuales es capaz de inmovilizar al menos un conjugado o un ligando objetivo.

El complejo de troponina en un músculo comprende troponina I, C y T. Estos componentes de troponina existen como isoformas específicas de varios tejidos. La troponina C existe como dos isoformas, una de músculo cardíaco y de contracción lenta y una de músculo de contracción rápida. Las troponinas I y T se expresan como isoformas diferentes en el músculo de contracción lenta, de contracción rápida y cardíaco (Biochem. J. 171, 251-259 (1978), J. Biol. Chem. 265, 21247-21253 (1990), Hum. Genet. 88, 101-104 (1991), Circul'. Res. 69, 1226-1233 (1991)). Las isoformas cardíacas únicas de troponina I y T les permiten ser distinguidas inmunológicamente de las otras troponinas del músculo esquelético. Por lo tanto, la liberación en la sangre de troponina I y T, desde el músculo cardíaco dañado, se ha relacionado con casos de angina inestable e infarto de miocardio. La técnica anterior, sin embargo, no ha abordado otras formas de troponina I y T en la sangre.

El complejo de troponina en el músculo está unido estrechamente al aparato contráctil. Aproximadamente el 6% de la troponina T en el tejido cardíaco existe como una proteína no unida en el citoplasma y se cree que este depósito de troponina T es liberado desde el músculo dañado (Am. J. Cardiol. 67, 1360-1367 (1991)).

Las conformaciones de troponina I, T y C cambian tras unirse cuando forman complejos binarios y ternarios (Biochemistry 33, 12800-12806 (1994), J. Biol. Chem. 254, 350-355 (1979), Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16, 535-559 (1987)). Una comprensión de los cambios conformacionales de la troponina I y la troponina T y la heterogenicidad de las proteínas en la sangre es crítica para el desarrollo de procedimientos de diagnóstico exactos para medir concentraciones de troponina I y troponina T. Además, se ha informado de que la troponina I es inestable en la sangre (Direction Insert for Troponin I Immunoassay, Sanofi/ERIA Diagnostics Pasteur, Marnes la Coquette, Francia), y los mecanismos responsables de la inestabilidad no se han comprendido. La presente invención proporciona un novedoso dispositivo de inmunoensayo que tiene una respuesta de ensayo fraccionario mejorada.

Divulgación de la invención

Se divulga un dispositivo de inmunoensayo tal como se define en las reivindicaciones 1 a 5.

Modos de realizar la invención

Definiciones

Tal como se usan en la presente memoria, un "anticuerpo" o "proteína receptora" se refieren a un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento de unión de un anticuerpo, un anticuerpo recombinante o una proteína receptora que se une específicamente a un objetivo. La unión específica a una sustancia significa la cualidad de esa sustancia por la que la sustancia tenderá a no unirse a algo a lo que no se une específicamente; por el contrario, la sustancia tendrá mayor afinidad por algo a lo que se une específicamente que por algo a lo que no se une específicamente.

Tal como se usa en la presente memoria, un anticuerpo insensible en un inmunoensayo es un anticuerpo que para cada forma de troponina de interés proporciona un valor de respuesta de ensayo que es el mismo dentro de aproximadamente un factor de 2, y preferentemente el mismo dentro de aproximadamente el 20%, que los valores de respuesta de ensayo para las otras formas de interés. De esta manera, un anticuerpo insensible es uno que exhibirá una detección de más de...

1. Dispositivo de inmunoensayo para medir la troponina I y/o T cardíaca, que comprende:

2. Dispositivo de inmunoensayo según la reivindicación 1, en el que el filtro ha sido secado después de aplicar troponina C.

3. Dispositivo de inmunoensayo según la reivindicación 1 ó 2, en el que la troponina C ha sido aplicada al filtro en una concentración desde 1 ng/ml a 1 mg/ml.

4. Dispositivo de inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la troponina C es troponina C humana o troponina C de conejo.

5. Dispositivo de inmunoensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que 0-1000 moles de calcio o magnesio han sido aplicados al filtro.