Método de preparación de muestras automatizable de aplicación universal.

Kit de reactivos para el aislamiento de ARN que comprende partículas de vidrio magnéticas cuya fase de vidriocontiene SiO2,

B2O3, Al2O3, CaO y K2O, así como

a) una proteasa,

b) un tampón de disgregación de muestra,

c) un tampón de lavado,

d) un tampón de elución.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07003878.

Solicitante: ROCHE DIAGNOSTICS GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: SANDHOFER STRASSE 116 68305 MANNHEIM ALEMANIA.

Inventor/es: HARTTIG, HERBERT, MARKERT-HAHN, CHRISTINE DR., KLEIBER,JOERG.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • B03C1/01 SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES.B03 SEPARACION DE SOLIDOS POR UTILIZACION DE LIQUIDOS O POR UTILIZACION DE MESAS O CRIBAS DE PISTON NEUMATICO; SEPARACION MAGNETICA O ELECTROSTATICA DE MATERIALES SOLIDOS A PARTIR DE MATERIALES SOLIDOS O DE FLUIDOS; SEPARACION POR CAMPOS ELECTRICOS DE ALTA TENSION.B03C SEPARACION MAGNETICA O ELECTROSTATICA DE MATERIALES SOLIDOS A PARTIR DE MATERIALES SOLIDOS O DE FLUIDOS; SEPARACION POR CAMPOS ELECTRICOS DE ALTA TENSION (filtros que utilizan la electricidad o el magnetismo B01D 35/06; separación de isótopos B01D 59/00; separación en que se combinan los procedimientos magnéticos o electrostáticos con los otros medios de separación de sólidos B03B, B07B; separación de hojas amontonadas B65H 3/00; imanes o bobinas magnéticas en sí H01F). › B03C 1/00 Separación magnética. › por adición de agentes magnéticos.
  • C03C17/30 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C03 VIDRIO; LANA MINERAL O DE ESCORIA.C03C COMPOSICION QUIMICA DE LOS VIDRIOS, VIDRIADOS O ESMALTES VITREOS; TRATAMIENTO DE LA SUPERFICIE DEL VIDRIO; TRATAMIENTO DE LA SUPERFICIE DE FIBRAS O FILAMENTOS DE VIDRIO, SUSTANCIAS INORGANICAS O ESCORIAS; UNION DE VIDRIO A VIDRIO O A OTROS MATERIALES.C03C 17/00 Tratamiento de la superficie del vidrio, p. ej., de vidrio desvitrificado, que no sea en forma de fibras o filamentos, por recubrimiento. › con compuestos que contienen silicio.
  • C07H1/08 C […] › C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 1/00 Procesos para la preparación de derivados de azúcar. › a partir de productos naturales.
  • C12Q1/68 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2398713_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método de preparación de muestras automatizable de aplicación universal

La presente invención se refiere a nuevos pigmentos magnéticos que son útiles para un procedimiento de preparación de muestras biológicas para la subsiguiente detección de un analito, en especial un ácido nucleico, en esta muestra.

En un procedimiento para la detección de un analito en una prueba biológica, la preparación de la muestra está a menudo sometida a exigencias especiales. Por un lado, el analito a menudo está presente en una concentración muy escasa y, por otro lado, se encuentran a menudo muchas otras sustancias en la muestra, que pueden perjudicar el aislamiento o la determinación del analito.

Por el documento WO 96/41811 se da a conocer un procedimiento para el aislamiento de un analito, en especial un ácido nucleico, de una muestra biológica, en el que la muestra que contiene el analito en un líquido es puesta en contacto con partículas magnéticas que presentan una superficie exterior de vidrio substancialmente libre de poros,

o con poros de un diámetro de < 10 nm, en condiciones en las que el analito se fija a la superficie de la partícula y el analito fijado es separado del líquido de muestra. El procedimiento descrito por el documento WO 96/46811 es muy apropiado para la purificación de un analito de una muestra biológica. Sin embargo, no puede ser utilizado sin más para una preparación automática de una muestra.

Boom y otros (J. Clin. Microbiol. 28 (1990) , 495-503) describen asimismo un protocolo para la purificación de ácidos nucleicos de una muestra biológica utilizando partículas de óxido de silicio de tamaño fraccionado. Sin embargo, este procedimiento es complicado, no es apto para una automatización y, además, existe el peligro de transmisiones.

Según un método descrito por el documento EP-A-0 757 106 para la extracción de ácidos nucleicos, se analiza una muestra, se fijan los ácidos nucleicos presentes en la muestra a partículas de metal superparamagnéticas, se eliminan las mismas del tubo de muestras mediante una pipeta y se separan, de esta manera, de los demás componentes de la muestra. Este procedimiento tiene el inconveniente de que se pueden producir pérdidas debido a la necesidad de eliminar el analito con una pipeta de la muestra. Además, la utilización de varios tubos de reacción conlleva el peligro de transmisiones y contaminaciones.

Por lo tanto, la presente invención se basa en el objetivo de proporcionar un nuevo procedimiento para la preparación de muestras con el que se eliminan los inconvenientes del estado de la técnica, como mínimo parcialmente. En especial, el nuevo procedimiento debe ser automatizable y presentar un perfil de temperatura lo más sencillo posible.

En este contexto, resultan oportunos los procedimientos para el aislamiento de un analito de una muestra biológica, que comprenden las etapas:

a) la disgregación de la muestra en un tubo de reacción, b) la adición de una matriz de adsorción sólida, c) la incubación en condiciones en las que el analito se fija a la matriz de adsorción, d) la eliminación de componentes de la muestra no fijados del tubo de reacción, e) la incubación en condiciones en las que el analito es eluido de la matriz de adsorción, y f) la separación del eluato de la matriz de adsorción.

En el contexto de la presente invención, asimismo resulta oportuno un procedimiento para el aislamiento de un analito de una muestra biológica, que comprende las etapas:

a) la disgregación de la muestra en un tubo de reacción, b) la adición de una matriz de adsorción sólida, c) la incubación en condiciones en las que el analito se fija a la matriz de adsorción, d) la separación de componentes de la muestra no fijados de la matriz de adsorción, e) la incubación en condiciones en las que el analito es eluido de la matriz de adsorción, y f) la separación del eluato de la matriz de adsorción,

en el que, como mínimo, las etapas (c) y (d) se llevan a cabo substancialmente a la misma temperatura.

El procedimiento descrito anteriormente se basa en la fijación selectiva de analitos a un matriz de adsorción sólida en presencia de un tampón de la disgregación de muestra, en el que el analito, que es preferentemente un ácido nucleico tal como ADN, por ejemplo, ADN cromosomal, ADN cromosomal fragmentado, ADN plasmídico, ADN viral, etc., o ARN, por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr o ARN viral, etc., es separado de impurezas de la muestra tales como, por ejemplo, proteínas o detritos celulares. La muestra puede ser una muestra biológica cualquiera, por ejemplo, un líquido corporal tal como sangre, plasma, orina, etc., una muestra de tejido, una muestra de células cultivadas o

similares.

La matriz de adsorción utilizada en el procedimiento descrito anteriormente es capaz de garantizar una fijación mayoritariamente selectiva del analito en las condiciones de reacción. Preferentemente, se utiliza una matriz de adsorción particular que presenta preferentemente una superficie de vidrio. Son muy preferentes las partículas de vidrio, en especial las partículas magnéticas descritas por el documento WO 96/41811 que presentan una superficie exterior de vidrio que es substancialmente libre de poros o presenta poros con un diámetro de menos de 10 nm. Son muy preferentes las partículas ferromagnéticas que presentan un tamaño entre 10 y 60 !m. Estas partículas pueden contener, por ejemplo, un núcleo de mica y partículas magnéticas inmovilizadas sobre el mismo que está envuelto por una capa de vidrio. Mientras que según el documento WO 96/41811 las partículas magnéticas se presentan en forma sólida, por ejemplo como pastillas o polvo, en los tubos de reacción utilizados en cada caso, de acuerdo con la invención se utiliza las partículas magnéticas preferentemente en forma de suspensión. Resultaron muy apropiadas las suspensiones alcohólicas con una concentración de aproximadamente 5 hasta 20 mg/ml. Sorprendentemente se ha comprobado que, a pesar de la elevada densidad específica de las partículas de vidrio magnéticas, la suspensión puede ser retirada de un depósito con alta reproducibilidad, debido a lo cual se hace posible automatizar la gestión del proceso.

Aunque las partículas de vidrio descritas en el documento WO 96/41811 muestren buenos resultados con el procedimiento descrito anteriormente, se obtienen resultados muy buenos con aquellas partículas de vidrio cuya fase de vidrio comprende los siguientes óxidos de metal: SiO2, B2º3, óxido de metal alcalino, por ejemplo K2O o/y Na2O, así como eventualmente Al2O3 y un óxido de metal alcalinotérreo, por ejemplo, CaO. Las porciones de estos óxidos de metal son preferentemente las siguientes: SiO2 desde 50 hasta 95 %mol, B2O3 desde 0, 2 hasta 30 %mol, Al2O3 desde 0 hasta 10 %mol, óxido de metal alcalinotérreo desde 0 hasta 20 %mol y óxido de metal alcalino desde 0, 2 hasta 20 %mol, donde las indicaciones porcentuales se refieren al peso total de la fase de vidrio.

Para el aislamiento de ARN ha resultado ser muy apropiado, por ejemplo, una fase de vidrio que contiene SiO2, B2O3, K2O, Al2O3 y CaO. Para el aislamiento de ADN ha resultado ser muy apropiado una fase de vidrio que contiene SiO2, B2O3 y Na2O.

Según el procedimiento descrito anteriormente, la matriz de adsorción se añade preferentemente en una cantidad que corresponde a la cantidad mínima que se necesita para una fijación cuantitativa del analito presente en la muestra, en especial un ácido nucleico, o a una cantidad algo superior, preferentemente como máximo un 50% por encima y, muy preferentemente, como máximo un 20% por encima de dicha cantidad. La cantidad de ácido nucleico que se espera encontrar en diferentes tipos de muestras se puede averiguar previamente – si no se conoce de antemano – mediante las técnicas habituales, por ejemplo, la extracción con fenol-cloroformo y la subsiguiente medición de la densidad óptica.

La etapa (a) del procedimiento descrito anteriormente comprende la disgregación de la muestra en un tubo de reacción. Esta disgregación se realiza generalmente mediante lisis de las células presentes en la muestra en condiciones desnaturalizantes, por ejemplo añadiendo una proteasa y un tampón de desnaturalización. Como proteinasa se utiliza preferentemente proteinasa K, pronasa, elastasa o/y lisozima. Muy preferente es la utilización de proteinasa K.

La digestión de proteasa se realiza en un tampón de desnaturalización, que contiene preferentemente un compuesto caotrópico, por ejemplo urea o derivados de la urea, preferentemente una sal caotrópica, muy preferentemente una sal de guanidina tal como, por ejemplo hidrocloruro... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Kit de reactivos para el aislamiento de ARN que comprende partículas de vidrio magnéticas cuya fase de vidrio contiene SiO2, B2O3, Al2O3, CaO y K2O, así como a) una proteasa, b) un tampón de disgregación de muestra, c) un tampón de lavado, d) un tampón de elución.

2. Partículas de vidrio magnéticas que comprenden un núcleo magnético y una envoltura de vidrio que contiene SiO2, B2O3, K2O y Al2O3, así como CaO.


 

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