Método de preparación de muestras automatizable de aplicación universal.

Kit de reactivos para el aislamiento de ARN que comprende partículas de vidrio magnéticas cuya fase de vidriocontiene SiO2,

B2O3, Al2O3, CaO y K2O, así como

a) una proteasa,

b) un tampón de disgregación de muestra,

c) un tampón de lavado,

d) un tampón de elución.

Método de preparación de muestras automatizable de aplicación universal

La presente invención se refiere a nuevos pigmentos magnéticos que son útiles para un procedimiento de preparación de muestras biológicas para la subsiguiente detección de un analito, en especial un ácido nucleico, en esta muestra.

En un procedimiento para la detección de un analito en una prueba biológica, la preparación de la muestra está a menudo sometida a exigencias especiales. Por un lado, el analito a menudo está presente en una concentración muy escasa y, por otro lado, se encuentran a menudo muchas otras sustancias en la muestra, que pueden perjudicar el aislamiento o la determinación del analito.

Por el documento WO 96/41811 se da a conocer un procedimiento para el aislamiento de un analito, en especial un ácido nucleico, de una muestra biológica, en el que la muestra que contiene el analito en un líquido es puesta en contacto con partículas magnéticas que presentan una superficie exterior de vidrio substancialmente libre de poros,

o con poros de un diámetro de < 10 nm, en condiciones en las que el analito se fija a la superficie de la partícula y el analito fijado es separado del líquido de muestra. El procedimiento descrito por el documento WO 96/46811 es muy apropiado para la purificación de un analito de una muestra biológica. Sin embargo, no puede ser utilizado sin más para una preparación automática de una muestra.

Boom y otros (J. Clin. Microbiol. 28 (1990) , 495-503) describen asimismo un protocolo para la purificación de ácidos nucleicos de una muestra biológica utilizando partículas de óxido de silicio de tamaño fraccionado. Sin embargo, este procedimiento es complicado, no es apto para una automatización y, además, existe el peligro de transmisiones.

Según un método descrito por el documento EP-A-0 757 106 para la extracción de ácidos nucleicos, se analiza una muestra, se fijan los ácidos nucleicos presentes en la muestra a partículas de metal superparamagnéticas, se eliminan las mismas del tubo de muestras mediante una pipeta y se separan, de esta manera, de los demás componentes de la muestra. Este procedimiento tiene el inconveniente de que se pueden producir pérdidas debido a la necesidad de eliminar el analito con una pipeta de la muestra. Además, la utilización de varios tubos de reacción conlleva el peligro de transmisiones y contaminaciones.

Por lo tanto, la presente invención se basa en el objetivo de proporcionar un nuevo procedimiento para la preparación de muestras con el que se eliminan los inconvenientes del estado de la técnica, como mínimo parcialmente. En especial, el nuevo procedimiento debe ser automatizable y presentar un perfil de temperatura lo más sencillo posible.

En este contexto, resultan oportunos los procedimientos para el aislamiento de un analito de una muestra biológica, que comprenden las etapas:

a) la disgregación de la muestra en un tubo de reacción, b) la adición de una matriz de adsorción sólida, c) la incubación en condiciones en las que el analito se fija a la matriz de adsorción, d) la eliminación de componentes de la muestra no fijados del tubo de reacción, e) la incubación en condiciones en las que el analito es eluido de la matriz de adsorción, y f) la separación del eluato de la matriz de adsorción.

En el contexto de la presente invención, asimismo resulta oportuno un procedimiento para el aislamiento de un analito de una muestra biológica, que comprende las etapas:

a) la disgregación de la muestra en un tubo de reacción, b) la adición de una matriz de adsorción sólida, c) la incubación en condiciones en las que el analito se fija a la matriz de adsorción, d) la separación de componentes de la muestra no fijados de la matriz de adsorción, e) la incubación en condiciones en las que el analito es eluido de la matriz de adsorción, y f) la separación del eluato de la matriz de adsorción,

en el que, como mínimo, las etapas (c) y (d) se llevan a cabo substancialmente a la misma temperatura.

El procedimiento descrito anteriormente se basa en la fijación selectiva de analitos a un matriz de adsorción sólida en presencia de un tampón de la disgregación de muestra, en el que el analito, que es preferentemente un ácido nucleico tal como ADN, por ejemplo, ADN cromosomal, ADN cromosomal fragmentado, ADN plasmídico, ADN viral, etc., o ARN, por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr o ARN viral, etc., es separado de impurezas de la muestra tales como, por ejemplo, proteínas o detritos celulares. La muestra puede ser una muestra biológica cualquiera, por ejemplo, un líquido corporal tal como sangre, plasma, orina, etc., una muestra de tejido, una muestra de células cultivadas o

similares.

La matriz de adsorción utilizada en el procedimiento descrito anteriormente es capaz de garantizar una fijación mayoritariamente selectiva del analito en las condiciones de reacción. Preferentemente, se utiliza una matriz de adsorción particular que presenta preferentemente una superficie de vidrio. Son muy preferentes las partículas de vidrio, en especial las partículas magnéticas descritas por el documento WO 96/41811 que presentan una superficie exterior de vidrio que es substancialmente libre de poros o presenta poros con un diámetro de menos de 10 nm. Son muy preferentes las partículas ferromagnéticas que presentan un tamaño entre 10 y 60 !m. Estas partículas pueden contener, por ejemplo, un núcleo de mica y partículas magnéticas inmovilizadas sobre el mismo que está envuelto por una capa de vidrio. Mientras que según el documento WO 96/41811 las partículas magnéticas se presentan en forma sólida, por ejemplo como pastillas o polvo, en los tubos de reacción utilizados en cada caso, de acuerdo con la invención se utiliza las partículas magnéticas preferentemente en forma de suspensión. Resultaron muy apropiadas las suspensiones alcohólicas con una concentración de aproximadamente 5 hasta 20 mg/ml. Sorprendentemente se ha comprobado que, a pesar de la elevada densidad específica de las partículas de vidrio magnéticas, la suspensión puede ser retirada de un depósito con alta reproducibilidad, debido a lo cual se hace posible automatizar la gestión del proceso.

Aunque las partículas de vidrio descritas en el documento WO 96/41811 muestren buenos resultados con el procedimiento descrito anteriormente, se obtienen resultados muy buenos con aquellas partículas de vidrio cuya fase de vidrio comprende los siguientes óxidos de metal: SiO2, B2º3, óxido de metal alcalino, por ejemplo K2O o/y Na2O, así como eventualmente Al2O3 y un óxido de metal alcalinotérreo, por ejemplo, CaO. Las porciones de estos óxidos de metal son preferentemente las siguientes: SiO2 desde 50 hasta 95 %mol, B2O3 desde 0, 2 hasta 30 %mol, Al2O3 desde 0 hasta 10 %mol, óxido de metal alcalinotérreo desde 0 hasta 20 %mol y óxido de metal alcalino desde 0, 2 hasta 20 %mol, donde las indicaciones porcentuales se refieren al peso total de la fase de vidrio.

Para el aislamiento de ARN ha resultado ser muy apropiado, por ejemplo, una fase de vidrio que contiene SiO2, B2O3, K2O, Al2O3 y CaO. Para el aislamiento de ADN ha resultado ser muy apropiado una fase de vidrio que contiene SiO2, B2O3 y Na2O.

Según el procedimiento descrito anteriormente, la matriz de adsorción se añade preferentemente en una cantidad que corresponde a la cantidad mínima que se necesita para una fijación cuantitativa del analito presente en la muestra, en especial un ácido nucleico, o a una cantidad algo superior, preferentemente como máximo un 50% por encima y, muy preferentemente, como máximo un 20% por encima de dicha cantidad. La cantidad de ácido nucleico que se espera encontrar en diferentes tipos de muestras se puede averiguar previamente – si no se conoce de antemano – mediante las técnicas habituales, por ejemplo, la extracción con fenol-cloroformo y la subsiguiente medición de la densidad óptica.

La etapa (a) del procedimiento descrito anteriormente comprende la disgregación de la muestra en un tubo de reacción. Esta disgregación se realiza generalmente mediante lisis de las células presentes en la muestra en condiciones desnaturalizantes, por ejemplo añadiendo una proteasa y un tampón de desnaturalización. Como proteinasa se utiliza preferentemente proteinasa K, pronasa, elastasa o/y lisozima. Muy preferente es la utilización de proteinasa K.

La digestión de proteasa se realiza en un tampón de desnaturalización, que contiene preferentemente un compuesto caotrópico, por ejemplo urea o derivados de la urea, preferentemente una sal caotrópica, muy preferentemente una sal de guanidina tal como, por ejemplo hidrocloruro... [Seguir leyendo]

1. Kit de reactivos para el aislamiento de ARN que comprende partículas de vidrio magnéticas cuya fase de vidrio contiene SiO2, B2O3, Al2O3, CaO y K2O, así como a) una proteasa, b) un tampón de disgregación de muestra, c) un tampón de lavado, d) un tampón de elución.

2. Partículas de vidrio magnéticas que comprenden un núcleo magnético y una envoltura de vidrio que contiene SiO2, B2O3, K2O y Al2O3, así como CaO.