APARATO PARA DETECTAR MOLECULAS DE UN BLANCO.

Dispositivo para detectar interacciones específicas entre moléculas de un blanco molecular y moléculas sonda,

que comprende:

una fuente de luz;

una cámara;

un soporte para un vaso de reacción hecho a medida para recibir exactamente al menos un vaso de reacción, que tiene un volumen de llenado de 100 µl a 2,5 ml, la forma típica de un vaso de reacción de laboratorio (tubo), una base plana en la que se dispone un elemento de soporte con las moléculas sonda inmovilizadas sobre ella en regiones predeterminadas y una tapa; y en donde el soporte para el vaso de reacción comprende un hueco de ajuste para la tapa del vaso de reacción

Aparato para detectar moléculas de un blanco.

La invención se refiere a un dispositivo así como al uso de dicho dispositivo para detectar interacciones específicas entre moléculas de un blanco y moléculas sonda.

Los ensayos biomédicos se basan a menudo en la detección de una interacción entre una molécula presente en posición y cantidad conocidas (la sonda molecular) y una molécula desconocida, que hay que detectar, o moléculas desconocidas que hay que detectar (las moléculas blanco y moléculas sonda). En los ensayos modernos las sondas están almacenadas en forma de una biblioteca de sustancias en soportes, los llamados micro-arrays o chips, de modo que una muestra puede analizarse al mismo tiempo paralelamente en varias sondas (D.J. Lockhart, E. A. Winzeler, Genomics, gene expression and DNA arrays; Nature 2000, 405, 827-836). Para la fabricación de los micro-arrays se inmovilizan (véase por ejemplo US 5,412,087, WO 98/36827) o generan sintéticamente (véase por ejemplo US 5,143,854) las sondas, por lo general de una manera prefijada, sobre una matriz apropiada, por ejemplo en el documento WO 00/12575.

La detección de una interacción entre la sonda y la molécula blanco se realiza habitualmente del siguiente modo: después de fijar la sonda o las sondas de un modo prefijado a una determinada matriz en forma de un micro-array, los blancos se ponen en contacto con las sondas en una solución y se incuban bajo determinadas condiciones. A consecuencia de la incubación, entre la sonda y el blanco tiene lugar una interacción específica. El enlace que se produce es claramente más estable que el enlace de moléculas blanco en sondas que no son específicas para la molécula blanco. Para retirar moléculas blanco que no se han fijado de manera específica, el sistema se lava o calienta con las soluciones correspondientes.

La detección de interacciones específicas entre un blanco y su sonda puede realizarse por multitud de procedimientos, que por lo general dependen del tipo de marcador que se lleva a la molécula blanco antes, durante o después de la interacción de la molécula blanco con el micro-array. De manera característica, los marcadores de este tipo son grupos fluorescentes de tal manera que pueden leerse de modo óptico-fluorescente interacciones blanco-sonda específicas con una alta resolución de lugar y, en comparación con otros métodos de detección convencionales, sobre todo los métodos sensibles a masas, con un pequeño esfuerzo (A. Marshall, J. Hodgson, DNA chips: An array of possibilities, Nature Biotechnology 1998, 16, 27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the art, Nature Biotechnology 1998, 16, 40-44).

Dependiendo de la biblioteca de sustancias inmovilizada en el micro-array y la naturaleza química de las moléculas blanco, basándose en este principio de test se pueden analizar interacciones entre ácidos nucleicos y ácidos nucleicos, entre proteínas y proteínas y entre ácidos nucleicos y proteínas (como resumen general véase F. Lottspeich, H. Zorbas, 1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin).

Como bibliotecas de sustancias que pueden inmovilizarse sobre micro-arrays o chips están bibliotecas de anticuerpos, bibliotecas de receptores, bibliotecas de péptidos y bibliotecas de ácidos nucleicos.

Las bibliotecas de ácidos nucleicos son, con mucho, las que asumen el papel más importante. Se trata de micro-arrays sobre los que se inmovilizan moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) o moléculas de ácido ribonucleico (ARN).

El requisito para el enlace de por ejemplo una molécula blanco, marcada con un grupo fluorescente en forma de una molécula de ADN o de ARN, con una sonda de ácido nucleico del micro-array es que, tanto la molécula blanco como también la molécula sonda estén en forma de un ácido nucleico de cadena simple. Sólo entre moléculas de este tipo puede tener lugar una hibridación eficiente y específica. Las moléculas blanco y sonda de ácido nucleico de cadena simple se obtienen por regla general mediante desnaturalización térmica y elección óptima de parámetros tales como temperatura, intensidad de los iones y concentración de moléculas de hélice desestabilizada. De este modo se garantiza que con la secuencia blanco sólo se aparean sondas con secuencias casi perfectamente complementarias, es decir, equivalentes entre sí (A. A. Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, I. J. Leitch, 1994 In vitro Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin Oxford).

Un ejemplo típico de la utilización de micro-arrays en procedimientos de ensayos biológicos es la detección de microorganismos en muestras para diagnóstico biomédico. Para ello se aprovecha el hecho de que los genes para el ARN ribosómico (ARNr) están distribuidos de modo ubiquista y de que disponen de secciones de secuencia que son características de cada especie. Estas secuencias características de una especie se llevan sobre un micro-array en forma de oligonucléotidos de ADN de cadena simple. Las moléculas de ADN blanco que deben analizarse se aíslan primero de la muestra que hay que analizar y se dotan de marcas, por ejemplo marcas fluorescentes. Finalmente, las moléculas de ADN blanco marcadas se incuban en una solución con sondas colocadas sobre el micro-array, las interacciones no específicas que aparecen se eliminan mediante los correspondientes pasos de lavado y las interacciones específicas se detectan mediante valoración óptico-fluorescente. De esta manera es posible detectar al mismo tiempo en un único ensayo de una muestra, por ejemplo, varios microroganismos. Con este procedimiento, el número de microorganismos detectables depende teóricamente sólo del número de sondas específicas que se hayan colocado sobre el micro-array.

Para la realización práctica de estos ensayos se fijan los micro-arrays o chips en cámaras cerradas, que disponen de entradas y salidas para cambiar los líquidos necesarios para los pasos de lavado y los pasos de hibridación.

Sistemas de este tipo se describen, por ejemplo, en US 6,287,850 y WO 01/02094. En DE 199 40 750 se describe un portador para procedimientos de determinación analítica que, después de ligeras modificaciones constructivas, es adecuado también para utilizar para aplicaciones de arrays en el marco de esta invención.

Para analizar secuencias de ADN se utilizan habitualmente bibliotecas de ADN ligadas a la superficie que están colocadas sobre portaobjetos. Para realizar la reacción de hibridación sobre estos portaobjetos se utilizan hasta la fecha cámaras de incubación o cámaras de hibridación especiales. Para garantizar la regulación de la temperatura y la mezcla de la solución de hibridación en estas cámaras conocidas hasta la fecha, se requiere un equipamiento especialmente adaptado para el dispositivo utilizado y, por consiguiente, complejo y caro.

En DE 101 49 684.2 se describe una celda de flujo que es adecuada para realizar un PCR y reacciones de hibridación sobre chips de ADN. La celda de flujo allí descrita es una pieza de construcción compleja, que va provista de una serie de características técnicas que no permiten el uso de equipamientos habitualmente utilizado en laboratorios, como por ejemplo una termomezcladora (Eppendorf, Alemania, Hamburgo) o una centrifugadora de laboratorio (Heraeus, Hanau, Alemania).

En WO 01/02094 se describe un cartucho que comprende un chip de ADN. En este cartucho puede realizarse un PCR así como una reacción de hibridación sobre un chip de ADN. En WO 95/33846 se describe un cuerpo con una cavidad en la que hay incorporada en zonas definidas un sustrato con moléculas de ácido nucleico de secuencia conocida. El cuerpo presenta un hueco cerrado en el que puede inyectarse el líquido de muestra. Los canales de llenado se hacen estancos mediante septos y se abren con cánulas apropiadas para llenar el cuerpo o el cartucho. La utilización de los cartuchos antes descritos requiere igualmente dispositivos especialmente previstos para ello.

En US 5,856,174 se describe un dispositivo integrado miniaturizado para diagnóstico de ácidos nucleicos. Este dispositivo permite recolectar una o más muestras, su preparación y la posterior realización de varios análisis de muestras. Un dispositivo de este tipo sirve para la realización automática de un análisis basado en el chip de ADN al unir en un cartucho y miniaturizar todos los pasos que se producen. La preparación de un dispositivo de este tipo es extraordinariamente trabajosa y cara.

Un dispositivo adicional se describe en la patente internacional WO 99/60381.

En...

1. Dispositivo para detectar interacciones específicas entre moléculas de un blanco molecular y moléculas sonda, que comprende:

una fuente de luz;

una cámara;

un soporte para un vaso de reacción hecho a medida para recibir exactamente al menos un vaso de reacción, que tiene un volumen de llenado de 100 µl a 2,5 ml, la forma típica de un vaso de reacción de laboratorio (tubo), una base plana en la que se dispone un elemento de soporte con las moléculas sonda inmovilizadas sobre ella en regiones predeterminadas y una tapa; y en donde el soporte para el vaso de reacción comprende un hueco de ajuste para la tapa del vaso de reacción.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que la cámara es una cámara CCD ó CMOS.

3. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de luz y la cámara están dispuestas en lados opuestos del soporte para el vaso de reacción.

4. Dispositivo según cualquiera de la reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de luz asegura una iluminación homogénea del soporte.

5. Dispositivo según cualquiera de la reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de luz es un array de iluminación que comprende varias fuentes de luz de radiación difusa, que por superposición aseguran una iluminación homogénea del portador.

6. Dispositivo según cualquiera de la reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de luz se selecciona de láseres, diodos de emisión de luz (LED), diodos de emisión superficial y/o lámparas de alta presión.

7. Dispositivo según cualquiera de la reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende filtros ópticos y, opcionalmente, una cambiador de filtros.

8. Dispositivo según cualquiera de la reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende un espejo semitransparente entre la fuente de luz y el portador.

9. Dispositivo según cualquiera de la reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende una unidad de control de temperatura.

10. Dispositivo según cualquiera de la reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de luz está montada en un brazo giratorio.

11. Dispositivo según cualquiera de la reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende un dispositivo de enfoque.

12. Dispositivo según cualquiera de la reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende un ordenador programado para recoger y/o evaluar las intensidades de señal detectadas, que opcionalmente está conectado mediante una interfaz a ordenadores externos.

13. Uso de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para llevar a cabo ensayos basados en microarrays.