Optimización de células para la activación endógena del gen.

LA INVENCION TRATA DE PROCEDIMIENTOS PARA OPTIMIZACION DE LA EXPRESION GENICA EN CELULAS.

UN PRIMER ASPECTO TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA VARIAR LA EXPRESION DE UN GEN DIANA QUE SE ENCUENTRA DE MANERA ENDOGENA EN UNA CELULA EUCARIOTICA MEDIANTE LA INTERRUPCION DE UNA SECUENCIA HETEROLOGA DE CONTROL DE EXPRESION EN EL GENOMA DE LA CELULA MEDIANTE UNA RECOMBINACION HOMOLOGA, ASI COMO LA SEPARACION DEL DNA EXTRAÑO INSERTADO MEDIANTE UNA RECOMBINASA ESPECIFICA DE LUGAR Y SU SUSTITUCION MEDIANTE OTRAS SECUENCIAS HETEROLOGAS DE CONTROL DE EXPRESION Y/O GENES DE AMPLIFICACION. ADEMAS TRATA LA INVENCION DE LA INTRODUCCION DE UNA O VARIAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO, A LAS CUALES SE UNE UNA PROTEINA DE UN ACTIVADOR O UN COMPLEJO DE PROTEINA DE ACTIVADOR, P. E. UN FACTOR INDUCIBLE DE LA HIPOXIA (HIF), EN EL GENOMA DE UNA CELULA EUCARIOTICA MEDIANTE RECOMBINACION HOMOLOGA, PARA VARIAR LA EXPRESION DE UN GEN DIANA. ADEMAS TRATA LA INVENCION DE UN PROCEDIMIENTO PARA PROBAR LA INFLUENCIA POR EL LADO 5'' O POR EL LADO 3 '' DE FRAGMENTOS NO CODIFICANTES DE ACIDO NUCLEICO EN LA EXPRESION DE UN GEN DIANA MEDIANTE LA DETERMINACION DE LA EXPRESION DE UN GEN INFORMADOR. ADEMAS TRATA LA INVENCION DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE UNA CELULA EUCARIOTICA DHFR - NEGATIVA Y QUE CONTIENE UNA SECUENCIA DIANA DE RECOMBINASA, ASI COMO LA EXPRESION DE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO INSERTO EN LA SECUENCIA DIANA DE RECOMBINASA.

Optimización de células para la activación endógena del gen.

La invención se refiere a un método para la optimización de la expresión o manifestación de un gen en las células. Un primer aspecto hace referencia a un método para modificar la expresión de un gen específico (objetivo) presente de forma endógena en una célula eucariótica introduciendo una secuencia de control heterológica de la expresión y de un modo opcional algo de gen de amplificación en el genoma de la célula por medio de una recombinación homóloga, así como al recorte del ADN externo insertado realizado a través de una recombinasa especifica del lugar, y a su sustitución por otras secuencias de heterológicas de control de la expresión o/y de los genes de amplificación.

La expresión de un gen en una célula puede efectuarse de forma constitutiva, por ejemplo, en los denominados genes Housekeeping, o bien de forma regulada. La expresión regulada es especialmente necesaria para los genes, los cuales deben ser expresados únicamente en un estadio de desarrollo determinado de la célula o bien en un cambio de las condiciones ambientales.

La expresión se regula a nivel de transcripción a través del promotor unido de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico codificada, cuya actividad puede ser controlada a través de represores y activadores. Un enlace de los represores o de los activadores a las secuencias de ácido nucleico no codificadas del gen puede producir una disminución o un aumento de la actividad del promotor (L. Stryer, Biochemie, capitulo 12, Spectrum der Wissenschaft, Verlagsgesellschaft, Heidelberg, 1990). La cantidad de represores o de activadores contenidos en una célula es regulada de nuevo por los factores como, por ejemplo, las condiciones ambientales. Un ejemplo de activadores son los factores que inducen hipoxia (HIF), que son inducidos por una oferta de O2 reducida y conducen a una elevada expresión del gen de eritropoyetina (Blanchard K.L, y cols.,Hypoxic induction of the human erythropoietin gene: Cooperation between the promotor and enhancer, each of which contains steroid receptor response elements,(1992), Mol.Cell.Biol.12,5373-5385: Wang G.L. y Semenza G.L., Characterization of hypoxia-inducible factor 1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia, (1993), J.Biol.Chem., 268, 21513-21518;Wang G.L., Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension, (1995), Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92, 5510-5514).

Además, la cantidad de una proteína expresada o manifestada depende de la estabilidad del ARNm. En un sector lateral 3' de un ARNm se localizan secuencias de reconocimiento para los enzimas desintegrados del ARNm, que influyen en la estabilidad del ARNm y por tanto en la magnitud de la expresión (Shaw G. y Kamen R.,A conserved AU sequence from the 3'untranslated Region of GM-CSF mRNA Mediates Selective mRNA Degradation, Cell(1986), 659-667). El periodo de semidesintegración del ARNm se correlaciona pues con la cantidad de proteína expresada. Un tercer nivel de la regulación de la expresión es la traslación.

La expresión de un gen se basa por tanto en unos mecanismos de regulación complejos, que pueden ser muy diferentes en cada caso.

Las proteínas pueden obtenerse con ayuda de la tecnología del ADN recombinante, que aprovecha los conocimientos de la regulación de la expresión (Sambrook u cols., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Col Spring Harbor). Para ello se emplean vectores que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína correspondiente bajo el control de un promotor adecuado, así como otras secuencias necesarias para la expresión de la proteína y para la replicación del vector. El vector se introduce entonces mediante un método conocido en una célula anfitriona, la célula se cultiva y la proteína recombinante puede obtenerse a partir de la célula o del medio de cultivo.

Como células anfitrionas se pueden emplear las células procarióticas o eucarióticas. Las procarióticas, en particular las células de E.coli, no son problemáticas en lo que se refiere a su manipulación, pero presentan una serie de inconvenientes en una expresión recombinante de proteínas eucarióticas.

Los procariotos y eucariotos se distinguen por una vía de procesamiento de la expresión, en las condiciones del medio celular así como en el Chaperon que interviene en el tratamiento de la proteína. Por eso pueden aparecer diferencias decisivas en una proteína eucariótica fabricada en los procariotos en comparación con la proteína nativa correspondiente. Por ejemplo, la muestra de plegamiento de la proteína y la actividad de la proteína varían. Además las proteínas en una célula procariótica generalmente no se glicosilan. Una muestra de glicosilacion correcta equivale en muchos casos, por ejemplo en la síntesis de proteínas para una formula farmacéutica a una característica decisiva para la eficacia y la tolerancia.

Las proteínas glucosiladas son fabricadas pues por medio de células anfitrionas eucarióticas o líneas celulares, por ejemplo CHO (Chinese Hamster Ovary). A pesar de la utilización de las células eucarióticas pueden aparecer cambios en la proteína fabricada de forma recombinante debido a las diferentes especies, por ejemplo, en la expresión de una proteína humana en células no humanas, lo que hace que esta no se pueda utilizar en muchas aplicaciones.

Para la fabricación recombinante de proteínas las células anfitrionas ocasionales o transitorias o bien estables son transfeccionadas con vectores de expresión, donde se emplean células transfeccionadas estables especialmente en un método de fabricación muy técnico.

La integración casual poco especifica de las secuencias del vector de expresión en el genoma de la célula puede llevar a células con un rendimiento de producción escaso o a unas propiedades celulares inestables. Por ejemplo, puede disminuir el rendimiento de producción en el transcurso del proceso de producción o bien la capacidad de las células de expresar la proteína recombinante puede perderse del todo.

Un método para el incremento de la expresión del gen es la amplificación del gen, en la cual una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína se acopla a un gen de amplificación. A través de una etapa de selección se consigue una replicación de ambas secuencias, que conduce a una expresión elevada (Schimke R.T.Ed)(1982), Gene amplifikation, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY).

Como gen de amplificación puede emplearse por ejemplo un ácido nucleico codificado para una dihidrofolatoreductasa (DHFR)(Kaufmann R.J.,Sharp P.A.(1982), Amplifikation and expression of sequences contransfected with a modular dihydrofolatereductase complementary DNA gene, J.Mol.Biol..159:601ff).

Mediante una etapa de selección llevada a cabo con metotrexato se obtienen células que son resistentes frente al metotrexato y que contienen en su genoma la secuencia de ácido nucleico en una amplificación de 20 hasta 50 veces codificada para una DHFR y acoplada con ella (R. Knippers, 1982, Moleculare Genetik, Thieme, Stuttgart).

Un método de amplificación del gen de este tipo se lleva a cabo del modo mas eficaz con una célula negativa DHFR. La JP-62265992 describe, por ejemplo, una célula negativa humana DHFR. Sin embargo, en esta célula no se halla ningún indicio de una integración especifica del lugar de un vector de expresión por medio de una recombinación homologa y una amplificación de esta secuencia.

Incluso al llevar a cabo un proceso de amplificación del gen pueden aparecer los inconvenientes anteriormente indicados como, por ejemplo la inestabilidad de las células, debido a la casual integración del vector de expresión en el genoma.

Únicamente en caso de una integración especifica del lugar del ADN externo en un locus genético seleccionado a través de una recombinación complementaria, se pueden evitar las inconvenientes descritos. Los métodos correspondientes son conocidos y se conocen como Gentargeting (WO 90/11354; WO 91/09955). Por lo que la célula es transfeccionada con un vector, que contiene un gen marcador de selección positivo, flanqueado por secuencias de ácido nucleico, que son complementarias a las secuencias de un gen locus, en las que el vector debe integrarse en el genoma de la célula. Entre las secuencias complementarias del ácido nucleico se halla otra secuencia de control de la expresión heterológica, para... [Seguir leyendo]

1. Método para modificar la expresión de una secuencia de ácido nucleico presente de forma endógena en una célula eucariótica, que se caracteriza porque

2. Método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque, se emplean secuencias loxP como secuencias objetivo de recombinasa.

3. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque, el vector comprende además un gen marcador de selección negativo, que está dispuesto por fuera de las secuencias complementarias según la reivindicación 1(a)(iv).

4. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque, la secuencia de ácido nucleico localizada entre las secuencias objetivo de recombinasa se recorta por la activación transitoria de una recombinasa del genoma de la célula, específica del lugar, que reconoce las secuencias objetivo.

5. Vector para la recombinación complementaria, que comprende

6. Procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 4, que se caracteriza porque

(a) la secuencia de ácido nucleico localizada entre las secuencias objetivo de recombinasa se recorta por la activación transitoria de una recombinasa del genoma de la célula, específica del lugar, que reconoce las secuencias objetivo,

(b) la célula es transfeccionada con otro vector, que comprende

(c) la célula transfeccionada se cultiva en unas condiciones en las cuales se realiza una integración de la secuencia flanqueada por las secuencias objetivo en la secuencia objetivo en un genoma de la célula,

(d) se consigue la célula obtenida según (c)

(e) si fuera preciso se repiten las etapas b hasta d al menos una vez con unas secuencias de control de la expresión variables o/y unos genes de amplificación.

7. Célula eucariótica, preferiblemente célula humana, que se caracteriza porque,

(a) contiene una secuencia de control de la expresión heterológica localizada en un cromosoma y si fuera preciso un gen de amplificación en acoplamiento operativo con un gen endógeno y donde

(b) la secuencia localizada en el cromosoma es flanqueada por secuencias objetivo de recombinasa.