Dispositivo adecuado para la investigación de interacciones ligando-receptor,

en particular para la investigación de una interacción diana de un analito tal como moléculas químicas y biológicas y componentes orgánicos y su interacción con superficies, que consiste en un elemento de reflexión interna total atenuada, transparente en el infrarrojo y del que al menos una superficie se activa químicamente mediante oxidación, hidroxilación o reducción y se injerta covalentemente con una molécula orgánica que puede inmovilizar el receptor

Modificación química de la superficie de elementos ópticos.

La invención se refiere a dispositivos adecuados para la investigación de interacciones ligando-receptor, en particular para la investigación de moléculas químicas o biológicas y componentes orgánicos y su interacción con superficies modificadas de manera adecuada.

Más en particular, la invención se refiere a métodos de activación química de la superficie e injerto covalente de elementos ATR (Attenuated Total Internal Reflection, reflexión interna total atenuada) y a su uso en dispositivos para FTIR (Fourier Transform Infra Red, infrarrojos con transformada de Fourier) para la detección, caracterización y dosificación de moléculas biológicas y compuestos orgánicos.

En otro aspecto, la invención también se refiere a elementos ATR injertados como tal.

Antecedentes de la técnica

Los biosensores (para una revisión detallada, véase: Leech D, Chem. Soc. Rev., 1994, 23, 205-213) son dispositivos basados en el reconocimiento específico de un analito de interés mediante una diana tal como un componente biológico, por ejemplo un receptor, un anticuerpo, una enzima, una membrana, una célula o medios que contienen células, una molécula, y la posterior transformación de esta interacción en una señal eléctrica, óptica o de otro tipo. Los biosensores ya han suscitado un profundo interés en muchos campos diferentes tales como control y diagnóstico médico, análisis ambiental y monitorización de procesos biotecnológicos.

Diferentes técnicas sensibles de superficie pueden aplicarse para detectar interacciones ligando-receptor, dependiendo de la naturaleza de los soportes del sensor. Hay métodos piezoeléctricos, espectroscopía de impedancia, microscopía y espectroscopía de resonancia de plasmón superficial (SPR, surface plasmon resonance), en el caso de superficies de oro u otro metal, por un lado, y espectroscopía de fluorescencia y óptica integrada, en el caso de superficies de vidrio (o TiO₂), por el otro lado.

Entre las técnicas anteriores, BIACORE International AB (Estocolmo) ha usado satisfactoriamente la espectroscopía SPR para desarrollar un instrumento comercial (Löfas S, Malmqvist M, Rönnberg I, Stenberg E, Liedberg B, Lundström I, Sensors Actuators B, 1991, 5, 79; Malmqvist M, Nature, 1993, 361, 186). La resonancia de plasmón superficial es una técnica sensible de superficie que puede detectar interacciones moleculares en tiempo real y en línea (para ejemplos seleccionados, véanse: Kooyman RPH, de Bruijn HE, Eenink RG, Greve J, J. Mol. Struct., 1990, 218, 345; Liedburg B, Nylander C, Lundström I, Sensors Actuators B, 1983, 4, 299; Karlsson R, Michaelsson A, Mattsson L, J. Immunol. Methods, 1991, 145, 229; Green RJ, Davies J, Davies MC, Roberts CJ, Tendler SJB, Biomaterials, 1997, 18, 405; Liedberg B, Lundström I, Stenberg E, Sensors Actuators B, 1993, 11, 63; Lahiri J, Isaacs L, Tien J, Whitesides GM, Anal. Chem., 1999, 71, 777).

Los biosensores basados en la técnica óptica de SPR hacen uso de las variaciones en el índice de refracción de un medio próximo a una película delgada de metal (oro) depositada sobre un sustrato (vidrio). Se producen modificaciones en el índice de refracción cuando un analito tal como una molécula o una proteína, por ejemplo se adsorbe o fija al sustrato de superficie; por consiguiente, se ve afectado el ángulo de mínima intensidad de la luz reflejada (el ángulo de resonancia). Intrínsicamente, esta técnica de detección, es decir la medición de la carga másica de la superficie, no puede proporcionar información estructural y mecanística sobre el analito de interacción. El acceso a información química, tal como la estructura molecular, empaquetamiento, orientación, ... e información con resolución temporal, tal como transiciones conformacionales que acompañan a las interacciones ligando-receptor, son prácticamente inaccesibles. Además, la técnica de SPR requiere la deposición de una película de metal, que habitualmente es oro sobre un soporte, y la inmovilización posterior de las dianas o los receptores biológicos de interés por medio del método de monocapas autoensambladas (SAM, self-assembled monolayers) basado en la quimiosorción de tensioactivos que contienen tiol (para ejemplos seleccionados, véanse Mrksich M, Whitesides GM, ACS Symp. Ser., 1997, 680, 361; Deng L, Mrksich M, Whitesides GM, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5136; Prime KL, Whitesides GM, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 10714) o por medio de la interacción con una matriz de dextrano amorfo. La presencia de esta película de metal (aproximadamente de 200 nm de profundidad) limita dramáticamente las posibilidades de detección superficial mediante técnicas altamente sensibles, tales como técnicas de fluorescencia o espectroscopía infrarroja que pueden aplicarse en medios acuosos. Por consiguiente, deben encontrarse conceptos y dispositivos novedosos para mejorar los soportes de biosensores y las técnicas de detección relacionadas.

La espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) es una técnica analítica extremadamente potente, particularmente bien adaptada para la caracterización de moléculas orgánicas y sistemas biológicos. Puede registrarse información conformacional y estructural cuantitativa. Se ha aplicado el método a la investigación de mono y multicapas de muestras bioorgánicas presentadas en los elementos ópticos, usando la configuración de reflexión interna total atenuada (ATR) (Scheuing DR, Fourier Transform Infra-Red Spectroscopy in Colloid and Interface Science, ACS Symposium Series nº 447, Am. Chem. Soc., Washington, 1991; Mirabella Jr FM (editor), Internal Reflection Spectroscopy, Theory and Applications, Marcel Dekker, Nueva York, 1993). De manera interesante, la configuración de ATR permite el estudio de analitos tales como moléculas y componentes biológicos o proteínas, por ejemplo en superficies en contacto con medios que contienen agua. El examen de la adsorción de proteínas sobre superficies de biomateriales es una de las aplicaciones relevantes (Chittur KK, Biomaterials, 1998, 19, 357). Recientemente, Vogel y colaboradores notificaron el efecto de la reducción del espesor de la capa de metal depositada en la superficie de un elemento ATR sobre la detección por infrarrojos de biomoléculas (Liley, M.; Keller, T.A.; Duschl, C.; Vogel, H. Langmuir 1997, 13, 4190-4192). Posteriormente, ha aparecido una solicitud de patente internacional que da a conocer métodos y dispositivos para la detección y la investigación de moléculas biológicas en (o dentro de) monocapas autoensambladas sobre superficies de metal usando espectroscopía infrarroja en la configuración de reflexión interna total atenuada (Vogel H, Keller T, Liley M; documento WO 99/05509). Esta descripción se basa en el uso de una película muy delgada de oro (de 5 a 30 nm) depositada sobre un elemento ATR, y la posterior formación de las SAM susceptibles de inmovilizar biomoléculas. Por tanto, se aprovecha la transparencia relativa de la película de metal delgada en el infrarrojo, mediante lo cual la reflexión interna del haz IR en la interfase entre el elemento ATR y el metal produce un campo evanescente que penetra a través de la película de metal y hacia la fase acuosa en el otro lado. Esto permite la toma de muestras de las SAM y biomoléculas fijadas en la interfase metal-agua.

Otras técnicas están disponibles para inmovilizar moléculas de interés sobre cristales ATR, tales como el recubrimiento con capas delgadas de polímeros sintéticos, tales como poliuretanos, poliestireno, polietileno, mediante colada por centrifugación (Lenk TJ, Ratner BD, Chittur KK, Gendreau RM, Langmuir, 1991, 7, 1755; Lenk TJ, Ratner BD, Chittur KK, Gendreau RM, J. Biomed. Mater. Res., 1989, 23, 549), y el recubrimiento con biocerámica, tal como hidroxiapatita, mediante bombardeo iónico (Ong JL, Chittur KK, Lucas LC, J. Biomed. Mater. Res., 1994, 28, 1337). En todos los casos, es decir, materiales de metal, polímero o cerámica, el espesor de la capa depositada parece ser un punto crucial porque no está permitido que cambie significativamente la naturaleza y la intensidad del campo evanescente.

La principal desventaja del uso de un película intermedia de metal, polímero o cerámica sobre la superficie del elemento ATR es la formación de una barrera para la transmisión de la luz, lo que da como resultado una limitación drástica de las posibilidades de detectar interacciones ligando-receptor que tienen lugar en la superficie ATR. Por tanto, existe una necesidad adicional de un método de modificación de la superficie de elementos ATR que...

1. Dispositivo adecuado para la investigación de interacciones ligando-receptor, en particular para la investigación de una interacción diana de un analito tal como moléculas químicas y biológicas y componentes orgánicos y su interacción con superficies, que consiste en un elemento de reflexión interna total atenuada, transparente en el infrarrojo y del que al menos una superficie se activa químicamente mediante oxidación, hidroxilación o reducción y se injerta covalentemente con una molécula orgánica que puede inmovilizar el receptor.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que la molécula orgánica es un derivado de silano de fórmula general

X₃Si-(CH₂)_n-(CF₂)_n'-Y, hskip0,3cm X₂(R₁)Si-(CH₂)_n-(CF₂)_n'-Y hskip0,3cm o hskip0,3cm X(R₁)(R₂)Si-(CH₂)_n-(CF₂)_n'-Y,

en las que

X es halógeno, preferiblemente Cl, Br o alcoxilo C₁-C₆, preferiblemente OMe, OEt;

n es de 1 a 20;

n' es de 0 a 20;

R₁, R₂ son independientemente alquilo C₁-C₆;

Y es Me, CF₃, CHF₂, CH₂F, CH=CH₂, CN, CH=O, epóxido, halógeno, SH, NH₂, OH, N=C=O; N=C=S, CO₂H o ésteres derivados de los mismos.

3. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que la molécula orgánica es un derivado de silano acoplado covalentemente con un brazo espaciador multifuncional de fórmula general

Z₁-(CH₂)_n-Z₂

en la que n es de 2 a 12;

Z₁-CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_n'-O-CH₂-Z₂

en la que n' es de 0 a 5;

en las que Z₁, Z₂ se eligen independientemente de aril-N₃ (sustituyente fotoactivable), CO₂H y formas activadas del mismo tales como éster N-hidroxisuccinimidílico, CH₂NH₂ y derivados activados tales como N-maleimida, CH₂OH y formas activadas tales como tosilatos, CH₂SH y formas activadas tales como derivados de ditiano, CH₂N=C=O o CH₂N=C=S.

4. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el elemento de reflexión interna total atenuada está compuesto por un material elegido del grupo que consiste en germanio, silicio, ZnSe, ZnS, AM-TIR (un vidrio amorfo de germanio, selenio y arsénico).

5. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el elemento de reflexión interna total atenuada es un cristal, que tiene preferiblemente una geometría trapezoidal, en forma de varilla o fibra.

6. Uso de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para estudiar interacciones ligando-receptor, en particular, moléculas biológicas o componentes orgánicos o sus interacciones o complejaciones o reacciones con moléculas biológicas o componentes orgánicos o moléculas solubles en agua en o dentro de la molécula orgánica injertada.

7. Método para la construcción de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende las etapas de:

8. Método según la reivindicación 7, en el que el injerto de superficie se realiza a través de acoplamiento covalente con un derivado de silano de fórmula general

X₃Si-(CH₂)_n-(CF₂)_n'-Y, hskip0,3cm X₂(R₁)Si-(CH₂)_n-(CF₂)_n'-Y hskip0,3cm o hskip0,3cm X(R₁)(R₂)Si-(CH₂)_n-(CF₂)_n'-Y,

en las que

X es halógeno, preferiblemente Cl, Br o alcoxilo C₁-C₆, preferiblemente OMe, OEt;

n es de 1 a 20;

n' es de 0 a 20;

R₁, R₂ son independientemente alquilo C₁-C₆;

Y es Me, CF₃, CHF₂, CH₂F, CH=CH₂, CN, CH=O, epóxido, halógeno, SH, NH₂, OH, N=C=O, N=C=S, CO₂H o ésteres derivados de los mismos.

9. Método según la reivindicación 8, que comprende además el acoplamiento covalente en el derivado de silano de un brazo espaciador multifuncional de fórmula general

Z₁-(CH₂)_n-Z₂

en la que n es de 2 a 12;

Z₁-CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_n'-O-CH₂-Z₂

en la que n' es de 0 a 5;

en las que Z₁, Z₂ son independientemente aril-N₃, CO₂H y formas activadas del mismo tales como éster N-hidroxisuccinimidílico, CH₂NH₂ y derivados activados tales como N-maleimida, CH₂OH y formas activadas tales como tosilatos, CH₂SH y formas activadas tales como derivados de ditiano, CH₂N=C=O o CH₂N=C=S.

10. Método según la reivindicación 7, en el que la molécula orgánica es un derivado de silano unido covalentemente con un brazo espaciador, siendo la fórmula general de dicha molécula orgánica:

X₃Si-(CH₂)_n-W-(CH₂)_n''-Z₂

en las que

n y n'' son idénticos o diferentes de 0-20;

X₃Si puede sustituirse por X₂(R₁)Si o X(R₁)(R₂)Si;

W es -NHCO-, -CONH-CH₂-, -OCH₂-, -NHCH₂-, -SCH₂-, -S-S-CH₂ o -CH=CH-.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el que se inmoviliza un receptor sobre la molécula orgánica.

12. Dispositivo que puede obtenerse mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 7-11.

13. Método para estudiar interacciones ligando-receptor, en particular moléculas biológicas o componentes orgánicos o sus interacciones o complejaciones o reacciones con moléculas biológicas o componentes orgánicos o moléculas solubles en agua en o dentro de la molécula orgánica injertada, usando un dispositivo según la reivindicación 12, que comprende las etapas de