Un procedimiento de optimización de un ensayo para detectar una concentración de un analito en un líquido de muestra,

usando dicho ensayo un dispositivo de ensayo que tiene una superficie, teniendo la superficie impresa sobre la misma un punto de calibración inmovilizado sitioespecífico que incluye una cantidad predeterminada del analito y un punto de ensayo que incluye un anticuerpo de captura para unir dicho analito, incluyendo dicho procedimiento las siguientes etapas: modificar dicha superficie aplicando un revestimiento de epoxisilano para proporcionar sitios de unión hidrófobos, sitios de enlace hidrófilos y sitios de enlace covalentes; imprimir dichas manchas de ensayo y dichos puntos de calibración sobre dicha superficie; aplicar el líquido de ensayo de la muestra al dispositivo de ensayo; ensayar la sensibilidad del ensayo; y modular la relación de dichos sitios de unión hidrófobos a dichos sitios de enlace hidrófilos a dichos sitios covalentes modulando el tiempo y la temperatura de cocción del recubrimiento de epoxisilano con el fin de optimizar la sensibilidad del ensayo

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a procedimientos para optimizar y para preparar un dispositivo de ensayo para llevar a cabo un ensayo para detectar una concentración de analito en una muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los procedimientos de análisis de ensayos para inmunodiagnóstico incorporan técnicas para medir errores que resultan de la técnica de ensayo defectuosa cuando los ensayos se han completado. Por ejemplo, la medición de la sensibilidad del ensayo caracteriza la sensibilidad por análisis estadístico clásico basado en mediciones repetidas de muestras de concentración baja para confirmar que el resultado de la muestra no es estadísticamente diferente de cero. Puesto que el error típico que se obtiene es inversamente proporcional a la raíz cuadrada del número de mediciones reales, este procedimiento no mide la sensibilidad inherente del ensayo.

Como se conoce en la técnica, la sensibilidad analítica es la concentración mínima o cambio detectable, en la que el patrón cero se mide varias veces y el límite de la sensibilidad se convierte en una concentración igual a 2-3 DT (desviación típica) de la M (la Media). Sin embargo, la precisión, que se conoce en la técnica como la proximidad de las mediciones de un analito en múltiples partes alícuotas de un volumen único y homogéneo de matriz, puede ser incorrecta en un orden de magnitud. El ajuste simultáneo de cualquier curva de calibración obtenida no crea una curva de valores de dosis–respuesta verdaderos. Esto da como resultado considerables errores en la sensibilidad real de un ensayo.

Para medir la exactitud, conocida en la técnica como la proximidad de la media de los resultados de ensayo obtenidos por el procedimiento para la concentración verdadera de analito, la exactitud se usa para definir cuánto se aproxima el valor medido medio al valor verdadero. La diferencia de la medición se conoce como el sesgo o el grado de exactitud. El sesgo puede estar muy por encima del rango del ensayo. En la técnica se sabe que es necesario desarrollar procedimientos para medir este valor verdadero.

La repetibilidad o precisión de un ensayo, definido como la proximidad de las mediciones individuales de un analito cuando el procedimiento se aplica repetidamente a múltiples partes alícuotas de un volumen único y homogéneo de matriz o el error calculado en un ensayo analítico, se conoce en la técnica como el porcentaje del coeficiente de variación (% CV). Las máquinas de análisis de ensayo automático pueden estar afectadas por variaciones en la concentración de muestra, temperatura, calor y efectos de borde, suspensión de partículas incompleta y precipitación de fase sólida. Los efectos de la precisión también son resultado de la separación de fracciones y errores de recuento. En los sistemas ópticos el error se debe a efectos de turbidez, presencia de fluoróforos, deterioro de las lámparas y detectores y deterioro a lo largo del tiempo de los reactivos. Estos factores en general conducen a disminuciones significativas de la relación de señal a ruido. Los errores de manipulación mecánica son resultado del mal pipeteo y los periodos de parada del instrumento.

Por lo tanto, la evaluación de la precisión de cualquier procedimiento analítico requiere la medición de la variabilidad a concentraciones conocidas y relevantes, usando disoluciones de control normalizadas o definidas para crear patrones de calibración de los valores iniciales. La determinación exacta de dichos calibradores se basa en la medición de concentraciones conocidas en series de dilución a intervalos predeterminados, las cuales después se interpolan. Están disponibles en el comercio disoluciones de referencia o patrones de referencia o bien se pueden preparar en el laboratorio, pero a menudo están calibrados con matrices normalizados, externos o combinados, los cuales pueden variar considerablemente de las muestras de ensayo del paciente real. Parte de la solución para superar estos errores es representar gráficamente la precisión frente a un amplio intervalo de concentraciones para obtener un perfil de precisión, o la calibración cuantitativa del ensayo.

También se ha mostrado que la reactividad cruzada, especificidad del ensayo, interferencias que producen sesgo, alteraciones en el antígeno, anticuerpo, sitios de unión, efectos gancho de dosis bajas (ensayo competitivo) y dosis altas (ensayo de tipo sándwich), interferencia de anticuerpos heterófilos, autoanticuerpos endógenos interferentes, complemento, factor reumatoide, interferencia en la unión de anticuerpos a la fase sólida, sustancias endógenas generadoras de señales, inhibidores enzimáticos, catalizadores y cofactores, expresan una actividad que induce a confusión en los ensayos, incluyendo reactividad cruzada, efectos matriz y arrastre de la muestra en los instrumentos y muestreadores de inmunoensayo automáticos.

Para aplicaciones clínicas, las muestras de control de calidad pueden no reflejar las concentraciones reales en el paciente, pueden no reflejar el espectro de analitos presente e interferir con la matriz de muestras y no seguir reflejando el contenido de las muestras del paciente. Las muestras de control de calidad pueden medir el rendimiento en intervalos de concentración discrepantes que pueden no reflejar puntos de decisión clínicos.

Los autores de la invención han desarrollado ensayos de micromatrices que proporcionan la detección rápida de la presencia de analitos en una muestra. Estas se describen en la solicitud de patente de EE.UU. 10/856.785 publicada como US2005/0266398 A1 y titulada "Method and Device for Rapid Detection and Quantitation of Macro and Micro Matrices". Los ensayos permiten las mediciones cuantitativas y cualitativas rápidas de la concentración de analito en una muestra. El analito se marca con un primer anticuerpo que se conjuga con un marcador detectable. Un dispositivo de ensayo típico define una cámara entre la parte de carga y la parte de lectura de modo que una parte líquida de la muestra se mueve de la parte de carga a la parte de lectura por acción capilar. En la parte de lectura están impresas las matrices de puntos de ensayo inmovilizadas sitioespecíficas. Las manchas de ensayo incluyen un segundo anticuerpo que se une a la superficie del dispositivo de ensayo y que está adaptado para unirse y marcar el analito. El dispositivo de ensayo también tiene matrices de puntos de calibración inmovilizadas sitioespecíficas que contienen cantidades predeterminadas de analito unido para la reacción con cantidades en exceso del primer anticuerpo marcado con el marcador detectable. Una vez que el analito conjugado se une a los puntos de ensayo, la medición del analito en los puntos de ensayo se puede determinar por comparación de la intensidad del marcador de los puntos de ensayo con la intensidad del marcador de los puntos de calibración y leer la concentración de analito de las curvas de calibración adecuadas.

En general, los inmunoensayos dependen implícitamente de la detección directa y medición de la señal generada por el número de sitios de adsorción de antígeno a anticuerpo. Los ensayos no competitivos identifican estos sitios de adsorción usando un anticuerpo secundario marcado, mientras que los ensayos competitivos miden sitios de adsorción no ocupados. Puesto que los inmunoensayos son función de la concentración de anticuerpo, volumen y constantes de afinidad, solamente si estos valores se mantienen constantes se podrán obtener mediciones comparativamente exactas. Sigue siendo necesario medir la cantidad real de analito en la muestra. La concentración de analito se mide por comparación con las matrices inmovilizadas sitioespecíficas de concentración precalibrada de los patrones de referencia internos.

Si se usan concentraciones precalibradas de patrón de referencia externo para crear curvas de calibración externa, esto proporciona una fuente constante de error en la conversión de la señal de detección interpolada en la concentración de analito que se supone que está presente en la muestra de ensayo. Se puede inducir un error adicional en la medición de anticuerpo a analito mediante el uso de un soporte o sustrato sólido en el que se adsorbe el antígeno o el anticuerpo. Aunque el aumento de carga de unión en el sustrato agrava errores adicionales de referencia externos, los ensayos de analitos ambientales están igualmente distorsionados.

Aunque la adsorción a superficies de soporte sólido aumenta por adición de fuerzas de unión hidrófobas, aumentar... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de optimización de un ensayo para detectar una concentración de un analito en un líquido de muestra, usando dicho ensayo un dispositivo de ensayo que tiene una superficie, teniendo la superficie impresa sobre la misma un punto de calibración inmovilizado sitioespecífico que incluye una cantidad predeterminada del analito y un punto de ensayo que incluye un anticuerpo de captura para unir dicho analito, incluyendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

modificar dicha superficie aplicando un revestimiento de epoxisilano para proporcionar sitios de unión hidrófobos, sitios de enlace hidrófilos y sitios de enlace covalentes;

imprimir dichas manchas de ensayo y dichos puntos de calibración sobre dicha superficie;

aplicar el líquido de ensayo de la muestra al dispositivo de ensayo;

ensayar la sensibilidad del ensayo; y

modular la relación de dichos sitios de unión hidrófobos a dichos sitios de enlace hidrófilos a dichos

sitios covalentes modulando el tiempo y la temperatura de cocción del recubrimiento de epoxisilano con el fin de optimizar la sensibilidad del ensayo.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha superficie es sustancialmente plana.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha superficie incluye una parte de carga para recibir la muestra y una parte de lectura para recibir dicha muestra desde la parte de carga, estando impresos los puntos de calibración y el punto de ensayo sobre dicha parte de lectura.

4. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que las manchas de ensayo y las manchas de calibración se imprimen en la superficie en condiciones de humedad relativa constante.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que el espesor de los puntos de ensayo y los puntos de calibración es aproximadamente el espesor de una sola capa molecular de adsorbato.

6. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que la humedad relativa constante está en el intervalo de 15% a 90%.

7. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la relación de las cargas de dichos sitios de unión hidrófoba a dicho sitio hidrófilo a dicho sitio covalente está en el intervalo relativo para asegurar la relación óptima de unión y adsorción del analito con unión óptima, mientras que se mantiene la fijación y función óptimas del anticuerpo marcador.

8. Un procedimiento según la reivindicación 1, para asegurar la adsorción óptima del anticuerpo de captura sin producir realineamiento estructural y espacial de la estructura del anticuerpo que inhiba la unión de anticuerpo-analito.

9. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la mancha inmovilizada sitioespecífica contiene un separador molecular.

10. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el punto inmovilizado sitioespecífico presenta el analito uniformemente dispersado.

11. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el punto inmovilizado sitioespecífico presenta el analito uniformemente dispersado con impedimento estérico minimizado.

12. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el punto inmovilizado sitioespecífico incluye un tampón que modula la superficie optimizado para obtener la unión óptima del conjugado y los agregados de complejo-analito conjugado.

13. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha superficie incluye sustratos para la unión de ADN, proteínas, glicoproteínas, lipopolisacáridos, péptidos, fármacos, lecitinas y otras moléculas por los grupos funcionales amino, tiol e hidroxilo, estando activados dichos grupos por epoxisilano.

14. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha superficie incluye vidrio activado por epoxisilano para la unión covalente de ADN, proteínas, glicoproteínas, lipopolisacáridos, péptidos, fármacos,

lecitinas y otras moléculas por los grupos funcionales amino, tiol e hidroxilo.

15. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el dispositivo de ensayo incluye un multiplexado de matrices de puntos de ensayo en gradiente y matrices de puntos de calibración inmovilizadas.

16. Un procedimiento según la reivindicación 13, que además comprende las etapas de introducir una primera y una segunda muestra en el dispositivo de ensayo y poner en contacto dichas matrices de puntos inmovilizadas sitioespecíficas con la segunda muestra, conteniendo la segunda muestra una sustancia especificada.

17. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el dispositivo de ensayo se configura para un óptimo ángulo de contacto del flujo de líquido para asegurar el caudal adecuado y controlado del líquido de ensayo en el dispositivo.

18. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el dispositivo de ensayo se configura para asegurar la adsorción óptima del analito sin producir realineamiento estructural y espacial de la estructura del analito que inhiba la unión de anticuerpo-analito.

19. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el dispositivo de ensayo incluye una pluralidad de compartimentos de muestra, comprendiendo los compartimentos de muestra una estructura integral, incluyendo cada uno de los compartimentos un multiplexado de matrices de puntos de ensayo en gradiente y matrices de puntos de calibración inmovilizadas impresas en los mismos.

20. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el recubrimiento de epoxisilano está formado por una disolución de monohidrato del ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) y 3-glicidiloxipropiltrimetoxisilano.