Oligonucleótido que comprende un ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 o un complementos de las mismas,

presentando el oligonucleótido entre 10 y 50 nucleótidos.

Reactivos y métodos para detectar Neisseria gonorrhoeae

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y de la química de los ácidos nucleicos. La invención proporciona métodos y reactivos para detectar patógenos, tales como Neisseria gonorrhoeae y, por consiguiente, también se refiere a los campos del diagnóstico y pronóstico médicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El género Neisseria consiste de bacterias aeróbicas Gram-negativas, incluyendo el patógeno humano N. gonorrhoeae, que es el agente causativo de la gonorrea. Las infecciones por N gonorrhoeae, que presentan una elevada prevalencia y baja mortalidad, generalmente se contrae mediante contacto sexual y típicamente afecta a las membranas mucosas de la uretra en los hombres y del endocérvix en las mujeres. Sin embargo, la infección también puede extenderse a otros tejidos. Por ejemplo, una infección genital en el hombre puede ascender por la uretra y producir síntomas de prostatis, mientras que en mujeres, una infección por N. gonorrhoeae del cérvix puede extenderse a los tubos de Falopio y finalmente provocar esterilidad, entre otras condiciones, si no se trata. El mecanismo patogénico de la N. gonorrhoeae implica la unión de la bacteria a células epiteliales no ciliadas mediante fimbrias. El mecanismo también incluye la producción de endotoxina y proteasas de IgA.

Con frecuencia se observa coinfección por N. gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis. Ambas infecciones son dos causas conocidas de embarazo ectópico y también pueden conducir a infertilidad si no se tratan. También existen causas conocidas de síndrome clínicos agudos de cervicitis mucopurulentos y enfermedad inflamatoria pélvica. Por lo tanto, la detección de las infecciones por N. gonorrhoeae y C. trachomatis, que pueden ser asintomáticas, especialmente en mujeres, resulta importante para las personas que necesitan tratamiento y para poblaciones más amplias con riesgo de contraer y propagar más las infecciones.

La detección e identificación de las infecciones bacterianas tradicionalmente se ha llevado a cabo mediante aislamiento en cultivo puro y siguiendo procedimientos de determinación que aplican los conociientos disponibles sobre el origen del espécimen, los requisitos de crecimiento, las características visibles del crecimiento, la morfología microscópica, las reacciones de tinción y las características bioquímicas. Por ejemplo, entre los métodos preexistentes de detección e identificación de las infecciones por N. gonorrhoeae se incluyen la tinción Gram, el cultivo en medio agar selectivo y ensayos en los que se utiliza citocromo oxidasa y carbohidratos. También se han descrito ensayos serológicos, entre ellos la coaglutinación y la tinción con anticuerpos fluorescentes, para la detección de N. gonorrhoeae. Los métodos basados en cultivos, aunque relativamente sensibles, generalmente resultan de aplicación lenta, incluyendo con frecuencia la incubación durante la noche, y son laboriosos. Los ensayos de tinción Gram y los basados en anticuerpos típicamente proporcionan resultados en menos de una hora, aunque generalmente son de menor sensibilidad que los métodos basados en cultivos.

La utilización de secuencias polinucleótidas específicas como sondas para la identificación de agentes infecciosos es una alternativa a los ensayos de identificación inmunológicos, que son problemáticos, y otras metodologías preexistentes. Por ejemplo, las sondas de ácidos nucleicos complementarias a las secuencias de ácidos nucleicos diana han sido utlizadas en procedimientos de hibridación, tales como las transferencias southern y las transferencias por puntos, para detectar la secuencia diana de ácidos nucleicos. Muchos de dichos procedimientos de hibridación dependen del cultivo y/o enriquecimiento del organismo y, de esta manera, resultan inadecuados para el diagnóstico rápido. La aparición de técnicas para la amplificación rápida de secuencias específicas de ácidos nucleicos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa, entre muchas otras, ha proporcionado un mecanismo para utilizar sondas específicas de secuencias directamente en especímenes clínicos, eliminando de esta manera el enriquecimiento y cultivo in vitro del patógeno antes de la realización del ensayo de hibridación. De esta manera, los ensayos de hibridación basados en la amplificación pueden proporcionar técnicas diagnósticas simples y rápidas para la detección de patógenos en muestras clínicas.

Muchas sondas utilizadas en la actualidad no presentan suficiente especificidad para diferenciar entre agentes patogénicos que presentan secuencias de ácidos nucleicos altamente homólogas, tales como N. gonorrhoeae, N. meningitidis y similares. Esto puede conducir a resultados de ensayo sesgados, incluyendo falsos positivos. Una consecuencia de este diagnóstico erróneo podría ser la administración a un paciente de un curso inapropiado de tratamiento.

La patente US nº 2005/0158768 da a conocer oligonucleótidos capaces de detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra. Sin embargo, los oligonucleótidos dados a conocer no son capaces de detectar específicamente Neisseria gonorrhoeae que comprende una secuencia variante en la repetición directa 9 (por ejemplo la cepa NG889) .

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente exposición proporciona métodos y reactivos para la detección rápida de Neisseria gonorrhoeae que son específicos de especie, es decir, sin detección sustancial de otras especies en el género Neisseria o de especies de otros géneros. Por ejemplo, los reactivos de detección de ácidos nucleicos de la exposición (por ejemplo sondas de ácidos nucleicos, anticuerpos específicos de especie, etc.) típicamente se unen a las secuencias de nucleótidos presentes en N. gonorrhoeae pero no en otras especies.Además, debido a que los pacientes infectados por N. gonorrhoeae con frecuencia también se encuentran infectados por Chlamydia trachomatis, la exposición también proporciona métodos de detectar concurrentemente N. gonorrhoea y C. trachomatis en las muestras. Este enfoque minimiza el número de procedimientos diagnósticos a los que se somete un paciente, lo que típicamente también minimiza el coste total del diagnóstico. Además de composiciones y mezclas de reacción, la exposición también se refiere a kits y sistemas para detectar dichos agentes patogénicos, y a medios informáticos y legibles por ordenador relacionados.

En un aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido que consiste de un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 ó complementos de las mismas. En otro aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido que comprende un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y complementos de las mismas, presentando el oligonucleótido entre 10 y 50 nucleótidos. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido que incluye un ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% (por ejemplo de por lo menos 95%, etc.) respecto a uno de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 ó complementos de las mismas. Típicamente, dichos oligonucleótidos son ácidos nucleicos cebadores, sondas de ácidos nucleicos, o similares en dichas realizaciones. En algunas de dichas realizaciones, los oligonucleótidos presentan 40 ó menos nucleótidos (por ejemplo 35 ó menos nucleótidos, 30 ó menos nucleótidos, etc.) . En algunas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden por lo menos un nucleótido modificado. Opcionalmente, los oligonucleótidos comprenden por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción desactivadora. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos incluyen por lo menos una variación modificada conservadoramente.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra, incluyendo el método: (a) poner en contacto ácidos nucleicos procedentes de una muestra con por lo menos una primera pareja de ácidos nucleicos cebadores que comprenden por lo menos un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante, en por lo menos una reacción de amplificación de ácidos nucleicos.... [Seguir leyendo]

1. Oligonucleótido que comprende un ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 o un complementos de las mismas, presentando el oligonucleótido entre 10 y 50 nucleótidos.

2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico presenta una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 ó el complemento de las mismas.

3. Oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos un nucleótido modificado.

4. Oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción desactivadora.

5. Método para detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto ácidos nucleicos de la muestra con por lo menos una primera pareja de ácidos nucleicos, comprendiendo dichos ácidos nucleicos cebadores por lo menos un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante, en por lo menos una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, y

(b) detectar los ácidos nucleicos y/o uno o más amplicones de los mismos de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a) , detectando de esta manera Neisseria gonorrhoeae en la muestra.

6. Método según la reivindicación 5, en el que (a) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos de la muestra con por lo menos una segunda pareja de ácidos nucleicos cebadores capaces de hibridarse con un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis, y (b) comprende detectar uno o más amplicones adicionales de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a) , detectando de esta manera Chlamydia trachomatis en la muestra.

7. Método según la reivindicación 5, en el que (b) comprende realizar un seguimiento de la unión entre los amplicones y uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos que se unen detectablemente a un ácido nucleico con una secuencia que consiste de SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica a la misma en la que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a SEC ID nº 36, o un complemento de SEC ID nº 36 ó la variante.

8. Método según la reivindicación 7, en el que por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende un ácido nucleico que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante.

9. Kit, que comprende:

(a) por lo menos un oligonucleótido que presenta entre 10 y 50 nucleótidos, comprendiendo el oligonucleótido por lo menos un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37a 38 y 40 a 45 y lavariante, y uno o más de entre:

(b) instrucciones para determinar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra mediante seguimiento de la unión entre los ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos procedentes de la muestra y el oligonucleótido, en el que la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra es desconocida o no se ha constatado, o

(c) por lo menos un recipiente para empaquetar por lo menos el oligonucleótido.

10. Kit según la reivindicación 9, en el que el oligonucleótido presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos,

en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante.

11. Kit según la reivindicación 9, que comprende además uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos 5 que se unen detectablemente a un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis.

12. Mezcla de reacción que comprende un conjunto de amplicones que presenta secuencias que corresponden a una o más subsecuencias de SEC ID nº 36, una variante sustancialmente idéntica a la misma en la que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a SEC ID nº 36, o un complemento de SEC ID nº 36 ó la variante, en donde los amplicones no presentan nucleótidos terminadores, en el que por lo menos un subconjunto del juego de amplicones se produce utilizando por lo menos un ácido nucleico cebador que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45, una variante sustancialmente idéntica de los mismos, en el que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una de entre SEC ID nº 37

a 38 y 40 a 45, y complementos de los SEC ID nº 37 a 38 y 40 a 45 y la variante.