Procedimiento para la preparación de ácido nucleico purificado y el uso del mismo.

LA INVENCION TRATA DE UNA PREPARACION DE ACIDO NUCLEICO CON UN CONTENIDO INFERIOR AL 1 % DE PROTEINA,

PREFERENTEMENTE INFERIOR AL 0,1 % DE PROTEINA, LIBRE DE BROMUROS DE ETIDIUM, FENOL, CLORURO DE CESIO Y DETERGENTES BASADOS EN OCTILFENOLPOLI(ETILENGLICOLETER) N , ASI COMO CON UN CONTENIDO INFERIOR A 1 EU/MG ADN DE ENDOTOXINAS. DICHA PREPARACION ES APTA COMO MEDICAMENTO, EN ESPECIAL EN EL CAMPO DE LA TERAPIA GENETICA.

Procedimiento para la preparación de ácido nucleico purificado y el uso del mismo

La presente invención hace referencia a la preparación de ácido nucleico purificado y su utilización, especialmente en genoterapia.

La preparación de ácido nucleico replicable se lleva a cabo habitualmente mediante la multiplicación del plásmido- DNA capaz de replicarse en bacterias gramnegativas, como por ejemplo la E. Coli. Tras la disgregación de la blomasa (generalmente lisis alcalina, con lisozima o ultrasonidos) se centrifuga y el sobrenadante se agita con fenol. A continuación, se realiza una ultracentrifugación en un gradiente de cloruro de ceslo. (Birnboim & Doly, Nucleic Acid Res. 7(1979) 1513-1523, Garger y cois., Biochem. Biophys.Res.Comm.117 (1983) 835-842). Sin embargo, este tipo de preparados contienen endotoxlnas, fenol, cloruro de cesio y/o bromuro de etidio como colorante.

Otro procedimiento se ha descrito en QIAGEN® Plasmid Handbook (Qiagen Inc., Chatsworth, USA) y en EP-B 0 268 946. Según este, tras la disgregación habitual el celisato obtenido en QIAGEN® -TIP, que contiene una resina QIAGEN® (un material soporte a base de gel de sílice), es cromatografiado. El inconveniente de este método es que las proteínas enlazadas al DNA no se disuelven por completo y por lo tanto la fracción plasmídica purificada contiene proteínas y especialmente endotoxinas (de la membrana de células huésped gramnegativas) en un ámbito considerable.

En otro método, tras la lisis alcalina de la E.coli-biomasa según Bimboin & Doly se realiza una cromatografía del sobrenadante de la centrifugación en unas condiciones altamente salinas sobre columnas de intercambio aniónico (por ejemplo, mono-Q, fuente Q de Pharmacia, Macroprep-Q de BioRad, Poros-Q de Perseptive Biosystems o bien HyperD-Q de Biosepra, comparados con Chandra y cois., Analyt. Bioche. 203(1992)169-172; Dion y cois., J. Chrom. 535(1990)127-147). Aquí también la fracción de plásmido purificada contiene proteínas y en particular endotoxinas en un umbral considerable.

En otro método es posible tras la lisis alcalina y la posterior extracción a base de fenol/cloroformo realizar una cromatografía sobre la filtración del gel (McCIung&Gonzales, Analyt.Biochem.177 (1989) 378-382;Raymond y cois., Analyt. Biochem. 173(1988) 125-133). Incluso tras esta limpieza, la preparación de plásmido contiene impurezas,

especialmente fenol.

En la WO 95/21177 y WO/95/21179 se ha descrito un método para el aislamiento y limpieza de ácidos nucleicos para su aplicación a la genoterapia, donde la limpieza se lleva a cabo básicamente mediante el centrifugado, filtrado, una cromatografía de afinidad o bien una cromatografía en un material de cromatografía inorgánico. Otro empobrecimiento de endotoxinas puede conseguirse entonces según la WO 95/21177, cuando en un proceso de limpieza el ácido nucleico se trata con un "tampón de eliminación de endotoxinas" que contiene un 10% de Tritón® X 100 y 40 mmol/l de tampón MOPS (tampón de 3-morfolino-1-propanosulfonato) o bien 50 mmol/l de tampón MOPS (WO 95/21179). Un inconveniente de este método es que de esta forma el ácido nucleico purificado contiene impurezas de Tritón® y tampón MOPS. Mediante este método puede ciertamente conseguirse un empobrecimiento de las endotoxinas del orden de unos 100 EU/mg de DNA (Qiagen News 1/96, 3-5) o bien según la WO 95/21179 de 10-17 EU/mg de DNA, no obstante no es posible otra nueva eliminación de endotoxinas.

Para una aplicación terapéutica, como por ejemplo la prevista para la genoterapia, se necesita sin embargo una preparación de ácido nucleico, que a ser posible esté libre de toda impureza (especialmente libre de endotoxinas). Sobre todo, el contenido en endotoxlnas de las preparaciones de plásmido es actualmente un problema no resuelto, como ha descrito por ejemplo Cotten y cois., Gene Therapie 1(1994) 239-246. Un contenido reducido en endotoxinas (aprox. 100 EU/mg de DNA) puede conseguirse según la tecnología actual, como por ejemplo según la WO 95/21177, únicamente, cuando los ácidos nucleicos se tratan con detergentes no iónicos, como por ejemplo el Tritón (Tampón eliminador de endotoxinas de WO 95/21177). El Tritón® tiene sin embargo un efecto biológico, como por ejemplo, alteraciones pulmonares o descenso de la tensión arterial (Fiedler, Lexicón der Hilfsstoffe für Pharmazie und Kosmetik und angrenzende Geblete (Tomo 9, 3a edición, 1989, Editio Cantor, DE)). El tampón MOPS requerido además contiene asimismo una sustancia problemática desde el punto de vista de una aplicación terapéutica.

Mediante la invención se elabora una preparación, un plásmldo-DNA de elevada pureza, en la cual se empobrecen las endotoxinas, preferiblemente sin bromuro de etidio, fenol, cloruro de ceslo, pollmlxlna o detergentes no iónicos, así como un método sencillo y eficaz para la purificación de dichos ácidos nucleicos, en particular para el empobrecimiento en endotoxinas.

El objeto de la invención es un plásmldo-DNA replicable en bacterias gramnegativas, con un contenido inferior al 0,1 % de proteínas y un contenido de 0,01-0,1 EU/mg de DNA en endotoxlnas. Este plásmido-DNA, preferiblemente,

estará libre de bromuro de etidio, fenol y cloruro de ceslo, de detergentes a base de oct¡lfenolpol¡(et¡lengl¡coleter)n, como por ejemplo detergentes de Tritón®, así como libre de sustancia tampón MOPS y de RNasa.

Por amplificación se entiende el aumento del número de copias de un ácido nucleico (especialmente de DNA y de plásmido-DNA) en base a la replicación de un vector. Por lo que a partir de un molde se fabrican una multitud de copias. Se replica un vector, que representa al ácido nucleico, o bien contiene el ácido nucleico clonado.

Por plásmido-DNA se entiende una molécula dúplex de DNA extracromosomal que habitualmente posee 1 hasta más de 200 kb y se presenta en las células huésped en una hasta cientos de coplas. Los plásmldos frecuentemente se utilizan para la construcción de vectores de clonación, para la transfecclón de células procarlótlcas y eucarióticas. Un aplicación terapéutica Importante está relacionada con la genoterapla ¡n vivo y ex vivo. La molécula plásmido- DNA puede cerrarse en forma lineal o circular. Se emplea preferiblemente un DNA de cierre circular.

Otro objetivo de la Invención es una composición farmacéutica que contenga una molécula de plásmido-DNA conforme a la invención en una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico, y si es preciso aditivos o material de relleno farmacéutico adicional.

Las endotoxinas son lipopolisacáridos a base de bacterias gramnegatlvas. Las endotoxlnas pueden actuar en chupadores como pirógenos e inducir un schock endotóxico. Los componentes básicamente tóxicos de las endotoxinas son los lípidos A, donde la parte de polisacárido interviene en la solubilidad del agua y la parte lipídica actúa tóxicamente. El efecto biológico de las endotoxinas en chupadores son especialmente una hlpersenslbilización así como otras reacciones, que van acompañadas de fiebre.

El plásmido-DNA se amplifica conforme al método estándar en E. Coli, una bacteria gramnegativa. Tras la fermentación, la biomasa obtenida se disgrega y se destruyen las células. Se liberan con ello las endotoxinas de la membrana celular. Esto significa que, tras la amplificación del ácido nucleico preparado conforme a la invención, especialmente del plásmido-DNA, en bacterias gramnegativas y especialmente en E.coli, se requiere un empobrecimiento de endotoxlnas cuando esta molécula de plásmido-DNA debe emplearse terapéuticamente.

Para una aplicación terapéutica de los ácidos nucleicos replicables preparados conforme a la invención, especialmente el plásmido-DNA, se emplearán, según la aplicación, dosis de 50 g hasta de 10 mg y superiores. La cantidad de la dosis depende de la enfermedad y del tipo de aplicación. En un aerosol, por ejemplo, para el tratamiento de la fibrosis quística, se emplearán dosis de 400 g y superiores. Lo mismo sirve para el plásmido- DNA encapsulado en un complejo lipídico (p.ej. en liposomas). Para poder disponer de cantidades de este tipo será preciso preparar el ácido nucleico replicable a gran escala. Para ello, se necesitan lotes de fermentación con 1-5kg de biomasa, donde puedan aislarse 1-5 g de ácido nucleico.

El objetivo de la invención es asimismo un proceso para la preparación de ácido nucleico, preferiblemente de un plásmido-DNA, con un contenido inferior a 1 EU/mg DNA, preferiblemente 0,01-0,1 EU/mg DNA de endotoxinas, que se caracterice por que el plásmido-DNA se multiplique en bacterias gramnegativas como la E.coli, la biomasa se disgregue y los componentes solubles... [Seguir leyendo]

1. Preparación de un plásmido DNA que es capaz de replicarse en bacterias gramnegativas que tiene un contenido en proteínas inferior al 0,1 % y un contenido en endotoxinas de 0,01 hasta 0,1 EU/mg DNA.

2. Preparación conforme a la reivindicación 1, libre de bromuro de etidio, fenol, cloruro de cesio, sustancia tampón MOPS y detergentes a base de octilfenolpoli(etilenglicoléter).

3. Composición farmacéutica, que contiene un plásmido DNA replicable con un contenido inferior al 0,1 % en 10 proteínas así como con un contenido de 0,01 hasta 0,1 EU/mg DNA de endotoxinas en una cantidad eficaz

terapéutica y opcionalmente sustancias auxiliares farmacéuticas, aditivos o rellenos.

4. Procedimiento para fabricar un ácido nucleico que tenga un contenido en endotoxinas inferior a 1 EU/mg, que se caracterice porque un plásmido que contiene el ácido nucleico se replica en bacterias gramnegativas, la

15 biomasa se destruye; se realiza una cromatografía de intercambio aniónico; se cromatografían los componentes

solubles son cromatografiados en hidroxilapatita y se aísla dicho ácido nucleico.

5. Uso de un plásmido DNA replicable que tiene un contenido en proteínas inferior al 0,1 % y un contenido en endotoxinas de 0,01 a 0,1 EU/mg, para fabricar un fármaco para la genoterapia ex vivo y/o in vivo.