Eritropoyetina de gran actividad específica.

Composición de EPO caracterizada porque consta de moléculas de EPO glicosiladas que contienen una cantidad promedio de al menos 3,

7 unidades de N-acetil-lactosamina respecto a una cadena de hidrato de carbono unida a N de una molécula de EPO o de al menos 11,1 unidades de N-acetil-lactosamina respecto a la glicosilación total en N de una molécula de EPO, en la cual las moléculas de EPO son el producto de una expresión de ADN endógeno en células humanas y la proporción de cadenas carbohidratadas con repeticiones de N-acetil-lactosamina respecto al número total de cadenas de hidrato de carbono es como mínimo del 10% y la composición de EPO tiene una actividad específica in vivo de al menos 175.000 UI/mg de proteína.

Eritropoyetina de gran actividad específica

La presente invención se refiere a nuevas composiciones de EPO con gran actividad específica, caracterizadas por un alto nivel de unidades de N-acetil-lactosamina o/y ramificaciones tetraantenarias en la estructura carbohidratada. Además la presente invención se refiere a un preparado farmacéutico que contiene una composición de EPO según la presente invención.

La eritropoyetina (EPO) es una glicoproteína humana que estimula la producción de glóbulos rojos. En el plasma sanguíneo de las personas sanas la EPO se encuentra en concentraciones muy pequeñas y por tanto no es posible proporcionarla de este modo en mayores cantidades.

Las patentes EP-B1- 148 65 y EP-B1- 25 564 describen la preparación de EPO recombinante humana en células CHO. La EPO descrita en la patente EP-B1- 148 65 presenta un alto peso molecular como EPO urinaria y ninguna O-glicosilación. Por otra parte la EPO procedente de células CHO descrita en la patente EP-B1- 25 564 está disponible en grandes cantidades y en forma pura.

Asimismo es conocida la obtención de EPO humana a partir de la orina de pacientes con anemia aplásica (Miyake y otros, J. Biol. Chem. 252 (1977), 5558-5564).

La EPO recombinante y la EPO urinaria se obtienen como mezcla de varias ¡soformas, de las cuales es sabido que se diferencian por su grado de sialización. Estas isoformas de EPO presentan distintos puntos isoeléctricos y se pueden separar por focalización isoeléctrica o electroforesis capilar (véase Tsao y otros, Biotech. Bioeng. 4 (1992), 119-1196; Nieto y otros, Anal. Commun. 33 (1996), 425-427; Tran y otros, J. Chromatogr. 542 (1991), 459-471; Bietot y otros, J. Chromatogr. 759 (1997), 177-184; Watson y otros Anal. Biochem. 21 (1993), 389-393). Las isoformas con el mayor número de ácidos siálicos presentan la máxima actividad específica, mientras que las que llevan el menor número tienen la más baja actividad (véase p.ej. Imai y otros, Eur. J. Biochem. 194 (199), 457-462; patente EP-A- 428 267).

Takeuchi y otros (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 (1989), 7819-7822) describen una relación de la actividad biológica con el contenido de ácido siálico y la proporción de estructuras carbohidratadas bi- y tetraantenarias. Takeuchi y otros llegan asimismo a la conclusión de que las unidades de N-acetil-lactosamina presentes en las estructuras carbohidratadas de la EPO no tienen relación con la actividad biológica.

Fukuda y otros (Blood 73 (1989), 84-89) se ocupan de la velocidad de eliminación de la EPO del torrente sanguíneo, que contribuye esencialmente a la actividad biológica, y llegan a la conclusión de que la EPO con mayor número de unidades de N-acetil-lactosamina se elimina más rápidamente de la circulación que la EPO sin unidades de N-acetil- lactosamina. Morimoto y otros (Glycoconjugate J. 13 (1996), 193-112) describen la separación de isoformas de EPO mediante cromatografía mono-Q, en que las respectivas fracciones individuales constan de pocas isoformas. Los estudios realizados con estas fracciones muestran una distribución uniforme de todas las estructuras en todas las fracciones. Se encuentra una correlación del contenido de estructuras bi- y tetraantenarias o del contenido de unidades de N-acetil-lactosamina con la actividad específica.

Por tanto se desprende del estado técnico citado que existe una correlación general de la actividad biológica con la estructura de azúcar, en concreto respecto al contenido de ácidos siálicos. En cambio no se encuentra ningún indicio de que la cantidad de estructuras tetraantenarias o/y de N-acetil-lactosamina tenga una correlación directa con la actividad biológica.

Sorprendentemente, al purificar preparados de EPO se comprobó que un aumento de la proporción de estructuras carbohidratadas tetraantenarias o/y de unidades de N-acetil-lactosamina en la estructura carbohidratada producía una mejora importante de la actividad biológica específica. Esto ocurre especialmente durante la preparación de EPO en una línea celular humana, según la solicitud de patente europea 97 112 64.4.

Las investigaciones comparativas de actividad entre preparados o isoformas de EPO individuales cuya estructura carbohidratada solo se diferencia básicamente por el contenido de unidades de N-acetil-lactosamina (unidades LE) demuestran que - a igual contenido de ácido siálico y casi la misma antenaridad - los preparados o isoformas con mayor proporción de unidades de N-acetil-lactosamina tienen significativamente una actividad superior. En este contexto se entiende como antenaridad el contenido medio relativo (en %) de cadenas carbohidratadas bi-, tri- o tetraantenarias unidas a N en los preparados o isoformas aisladas de EPO, respecto al número total de cadenas carbohidratadas unidas a N. Además se encontró concretamente que en los preparados o isoformas con elevado contenido de estructuras triantenarias la cantidad total de unidades de lactosamina tenía considerable importancia para la actividad in vivo. Incrementando el contenido total de unidades de N-acetil-lactosamina, p.ej. en forma de alargamientos adicionales de la estructura principal con unidades LE (las llamadas repeticiones), se puede aumentar considerablemente la actividad biológica. Asimismo se comprobó que aumentando la proporción de estructuras tetraantenarias se puede mejorar la actividad biológica.

Por tanto si hay que producir un preparado de EPO con la mayor actividad específica posible y gran rendimiento, las operaciones de purificación, las células productoras o/y sus cultivos deben optimizarse para tener una proporción lo más alta posible de estructuras carbohidratadas tetraantenarias o/y un contenido lo más grande posible de unidades de N-acetil-lactosamina.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una composición de EPO que consta fundamentalmente de moléculas de EPO glicosiladas que llevan un número promedio de al menos 3,7, preferiblemente de al menos 4,, con especial preferencia de al menos 4,3 y sobre todo de al menos 4,5 unidades de N-acetil-lactosamina respecto a la composición media por cadenas carbohidratadas unidas a N de la molécula de EPO o un número promedio de al menos 11,1, preferiblemente de al menos 12,, con especial preferencia de al menos 13, y sobre todo de al menos 13,5 unidades de N-acetil-lactosamina respecto a todas las 3 estructuras carbohidratadas unidas a N (glicosilación total en N) de la molécula de EPO.

Las moléculas de EPO son el producto de una expresión de ADN endógeno en células humanas. La proporción de cadenas carbohidratadas con repeticiones de N-acetil-lactosamina respecto al número total de cadenas de hidrato de carbono es como mínimo del 1%. La composición de EPO tiene una actividad específica in vivo de al menos 175. Ul/mg de proteína.

La composición de EPO consta básicamente, con preferencia, de moléculas de EPO glicosiladas que tienen un valor de al menos 13, preferiblemente de al menos 135, con especial preferencia de al menos 14 y sobre todo de al menos 16, igual al número total promedio de unidades de N-acetil-lactosamina por molécula de EPO multiplicado por el contenido medio de ácido siálico por molécula de EPO.

En este contexto la Indicación "básicamente" significa que las moléculas de EPO deseadas se encuentran en una proporción preferente de al menos el 8%, con especial preferencia de al menos el 9% y sobre todo de al menos el 95% respecto a la cantidad total de moléculas de EPO en la composición.

El límite superior del contenido de estructuras tetraantenarias puede llegar hasta el 1% del total de cadenas carbohidratadas, de modo que cada estructura tetraantenarla contenga 4 unidades de N-acetil-lactosamina en la estructura principal del azúcar unido a N. El número de unidades de N-acetil-lactosamina, tanto en cada estructura carbohidratada como en la glicosilación, se puede aumentar con unidades adicionales de N-acetil-lactosamina como repeticiones de alargamiento de la estructura principal. El número de unidades de N-acetil-lactosamina por sitio de glicosilación (es decir, por estructura carbohidratada unida a N) puede llegar así hasta 6 (1 estructura tetraantenaria y 2 unidades adicionales de N-acetil-lactosamina en forma de repeticiones) (véase fig. 1) o - en estructuras con más de 2 unidades adicionales de N-acetil-lactosamina como repeticiones - incluso más. Respecto a la glicosilación total (3 estructuras carbohidratadas unidas a N) el número de unidades de N-acetil-lactosamina puede ser de 18 o más.

La composición según la presente invención puede constar de una o más ¡soformas, es decir moléculas de EPO con distintos puntos isoeléctricos en la focalización isoeléctrica. La composición según la presente... [Seguir leyendo]

1. Composición de EPO caracterizada porque consta de moléculas de EPO glicosiladas que contienen una cantidad promedio de al menos 3,7 unidades de N-acetil-lactosamina respecto a una cadena de hidrato de carbono unida a N de una molécula de EPO o de al menos 11,1 unidades de N-acetil-lactosamina respecto a la glicosilación total en N de una molécula de EPO, en la cual las moléculas de EPO son el producto de una expresión de ADN endógeno en células humanas y la proporción de cadenas carbohidratadas con repeticiones de N-acetil-lactosamina respecto al número total de cadenas de hidrato de carbono es como mínimo del 1% y la composición de EPO tiene una actividad específica in vivo de al menos 175. Ul/mg de proteína.

2. Composición de EPO según la reivindicación 1, caracterizada porque lleva moléculas de EPO glicosiladas en las cuales el valor del producto del número promedio de unidades de N-acetil-lactosamina respecto a una cadena carbohidratada unida a N multiplicado por el contenido medio de ácido siálico por molécula de EPO es como mínimo de 43,3 o bien de 13 respecto a la glicosilación total en N de una molécula de EPO.

3. Composición de EPO según la reivindicación 2, caracterizada porque el valor del producto es de al menos 46,7 respecto a una cadena carbohidratada unida a N o de al menos 14 respecto a la glicosilación total en N.

4. Composición de EPO según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque contiene una mezcla de las isoformas 2 hasta 5.

5. Composición de EPO según la reivindicación 4, caracterizada porque contiene una mezcla de las isoformas 3 hasta 4.

6. Composición de EPO según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque presenta una actividad específica in vivo de al menos 2. Ul/mg de proteína.

7. Composición de EPO según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el contenido medio de ácido siálico por molécula es de al menos 11.

8. Composición de EPO según una de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque las células han sido cultivadas en un medio libre de suero.

9. Preparado farmacéutico caracterizada porque contiene como principio activo una composición de EPO según una de las reivindicaciones 1 a 8, si es preciso junto con los diluyentes, excipientes y soportes farmacéuticos usuales.