Proceso para preparar polipéptidos con glicolización adecuada.

Proceso para aumentar el grado de glicolización al preparar un polipéptido glicolizado a partir de células de mamíferos o de insectos,

el cual consiste en cultivar las células de mamíferos o de insectos en un medio de cultivo adecuado y obtener el polipéptido deseado de las células o/y del sobrenadante del cultivo, caracterizado porque durante el cultivo se efectúa una adición de nutrientes - que comprende al menos dos carbohidratos - controlada y ajustada al consumo, en función de la correspondiente demanda de las células.

Proceso para preparar polipéptidos con glicolización adecuada La presente invención se refiere a un proceso para incrementar el grado de glicolización durante la preparación de un polipéptido mediante el cultivo de células humanas y a la obtención del polipéptido originado en el medio de cultivo y/o en las células. En este proceso el deseado polipéptido glicolizado puede ser producido por recombinación mediante activación genética endógena o de modo natural por parte de las células.

La preparación de glicoproteínas mediante el cultivo de células eucariotas se lleva a cabo generalmente en medios de cultivo habituales del comercio. Entonces puede ser necesario añadir ciertos substratos al medio de cultivo, para conseguir la glicolización deseada del polipéptido. Esto está descrito en la patente japonesa H6-292 592 para un proceso discontinuo en pequeños volúmenes (< 1000 ml) , con una reducida densidad celular inicial (5 × 104 células/ml) y un tiempo de cultivo corto (48 h) , tomando como ejemplo un anticuerpo IgM humano. En dicho proceso,

para la preparación recombinante de anticuerpos en células de mamíferos, p.ej. en células CHO, en vez de la glucosa normalmente empleada se usa otro azúcar, por ejemplo fructosa, manosa, galactosa, N-acetilglucosamina, ribosa, fucosa, N-acetilgalactosamina o similar. Asimismo se revela un método de cultivo en varias etapas, que consiste en cultivar primero las células en un medio que lleva glucosa, el cual se intercambia luego con un medio que contiene otro azúcar.

Sin embargo, el proceso descrito en la patente japonesa H6-292 592 tiene serios inconvenientes. El consumo del azúcar durante el cultivo celular hace variar continuamente su concentración en el medio de cultivo y por lo tanto no se puede garantizar que el grado de glicolización de los polipéptidos sea elevado y estable. Además, el proceso discontinuo no es adecuado cuando la glicolización deseada requiere una concentración constante del substrato, ya que las concentraciones iniciales de los substratos disminuyen continuamente debido al metabolismo celular. Asimismo, las grandes concentraciones de azúcar necesarias para tener densidades celulares altas y un grado de glicolización elevado y constante deben establecerse ya al comienzo de la fermentación, pero en estas condiciones se inhibe el crecimiento de las células y por lo tanto se limita la densidad celular que podría alcanzarse. Por consiguiente, con el proceso descrito en la patente japonesa antes citada no es posible una producción rentable de polipéptidos altamente glicolizados.

Es conocido el cultivo de células eucarióticas mediante un proceso discontinuo con alimentación simultánea (de carga alimentada) , en el cual se agrega solución nutriente durante el cultivo. Con este tipo de proceso, empleando una realimentación adecuada, se puede lograr una mayor densidad celular y un cultivo más duradero. Bajo este 35 aspecto hay que mencionar la publicación de Ljunggren y Häggström (Biotech. Bioeng. 44 (1994) , 808-818) , donde se describe la influencia de los cultivos limitados de substrato y realimentados en la obtención de un anticuerpo a partir de células de ratón. En este caso, las células se cultivan bajo la adición controlada de glucosa y glutamina. Los autores encontraron una disminución de productos secundarios no deseados y un efecto positivo sobre la producción de anticuerpos, debido a las bajas concentraciones de glucosa y glutamina. Otro ejemplo es la alimentación continua y limitada del aminoácido esencial glutamina, lo cual produce un crecimiento celular mejorado (Ljunggren y otros, Biotech. Lett. 12 (1990) , 705-710) . El objeto de la alimentación de glutamina es reducir la formación de amoniaco, que es tóxico para las células animales (Mirabet y otros, Biotechnol. Bioeng. 56 (1997) , 530537) .

Gawlitzek y otros (Biotechnol. Bioeng. 57 (1998) , 518-528) señalan que, debido a las altas concentraciones de iones amonio o de glucosamina en el medio de cultivo de células eucariotas BHK-21, se encuentra un aumento en la complejidad de las estructuras de carbohidrato unidas a N en las glicoproteínas recombinantes segregadas por las células cultivadas. Sin embargo, este hallazgo se contradice con los resultados de Bor y s y otros (Biotechnol. Bioeng. 43 (1994) , 505-514) o de Andersen y Goochee (Biotechnol. Bioeng. 47 (1995) , 96-105) que comprobaron cómo las 50 mayores concentraciones de amonio en el medio de cultivo inhibían la glicolización. Por tanto, es evidente que el control de la formación de amonio en el cultivo solo es un aspecto aislado e insuficiente, para preparar proteínas adecuadamente glicolizadas de manera rentable.

El grado de glicolización de los polipéptidos puede tener una gran influencia en su actividad biológica, lo cual se 55 demuestra en el siguiente ejemplo de la eritropoyetina (EPO) . La EPO es una glicoproteína humana que estimula la producción glóbulos rojos. La EPO se halla en el plasma sanguíneo de las personas sanas a concentraciones muy bajas, de manera que por esta vía no es posible prepararla en grandes cantidades. Las patentes EP-B-0 148 605 y EP-B-0 205 564 describen la preparación de EPO humana recombinante en células CHO. La EPO descrita en la patente EP-B-0 148 605 presenta un peso molecular mayor que el de la EPO urinaria y ninguna O-glicolización. La 60 EPO descrita en la patente EP-B-0 205 564 a partir de células CHO está disponible, entretanto, en grandes cantidades y en forma pura.

También es conocida la obtención de EPO humana a partir de la orina de pacientes con anemia aplásica (Miyake y otros, J. Biol. Chem. 252 (1977) , 5558-5564) .

La EPO recombinante y la EPO urinaria se obtienen como mezcla de distintas isoformas, de las cuales es sabido que se diferencian por su grado de sialilación. Estas isoformas de EPO presentan distintos puntos isoeléctricos y pueden separarse por enfoque isoeléctrico o por electroforesis capilar (véase Tsao y otros, Biotech. Bioeng. 40 (1992) , 1190-1196; Nieto y otros, Anal. Commun. 33 (1996) , 425-427; Tran y otros, J. Chromatogr. 542 (1991) , 459

471; Bietot y otros, J. Chromatogr. 759 (1997) , 177-184; Watson y otros, Anal. Biochem. 210 (1993) , 389-393) . Las isoformas con mayor número de ácidos siálicos poseen la máxima actividad específica, mientras que las de menor número tienen la actividad más baja (véase p.ej. Imai y otros, Eur. J. Biochem. 194 (1990) , 457-462; patente EP-A-o 428 267) .

Takeuchi y otros, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) , 7819-7822) describen una relación de la actividad biológica con el contenido de ácido siálico y la proporción de estructuras de carbohidrato bi- y tetrarramificadas. Takeuchi y otros llegan también a la conclusión de que las unidades de N-acetil-lactosamin-disacárido presentes en las estructuras de carbohidrato de la EPO no tienen ninguna relación con la actividad biológica.

Fukuda y otros (Blood 73 (1989) , 84-89) se ocupan de la velocidad de eliminación de EPO de la circulación sanguínea, que contribuye de manera esencial a la actividad biológica, y llegan a la conclusión de que la EPO con un mayor número de unidades de N-acetil-lactosamina se elimina más rápidamente de la sangre que la EPO sin unidades de lactosamina. Morimoto y otros (Glycoconjugate J. 13 (1996) , 1093-1120) describen la separación de isoformas de EPO por cromatografía de intercambio iónico mediante columna mono-Q, de modo que cada fracción individual solo consta de pocas isoformas. Los análisis efectuados con estas fracciones muestran una distribución equivalente de todas las estructuras en todas las fracciones. No se encuentra ninguna relación entre el contenido en estructuras bi- y trirramificadas o el contenido en unidades de N-acetil-lactosamina y la actividad específica.

Por lo tanto, del citado estado técnico se infiere que existe una correlación general de la actividad biológica con la 25 estructura de los azúcares, sobre todo en cuanto al contenido en ácidos siálicos.

Sorprendentemente se comprobó que con una alimentación continua de substratos carbohidratados ajustada al consumo durante una fermentación de elevada densidad celular y con el uso de una mezcla de glucosa, manosa y galactosa durante el cultivo, se logra un gran rendimiento de la proteína deseada, por ejemplo de la EPO, con un alto grado de glicolización.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere, por lo tanto, a un proceso para incrementar el grado de glicolización al preparar un polipéptido glicolizado a partir de células de mamíferos, que consiste en cultivar las células de mamíferos en un medio adecuado y extraer el polipéptido deseado de las células y/o del sobrenadante del cultivo. El proceso se caracteriza...

1. Proceso para incrementar el grado de glicolización al preparar un polipéptido glicolizado a partir de células de mamíferos, que consiste en cultivar las células de mamíferos en un medio de cultivo idóneo y obtener el polipéptido deseado de las células o/y del sobrenadante del cultivo, caracterizado porque las células de mamíferos son células humanas y durante el cultivo se efectúa una adición de nutrientes, controlada y ajustada al consumo, que comprende glucosa, manosa y galactosa, en función de la correspondiente demanda de las células.

2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque además durante el cultivo se efectúa una adición de al menos un aminoácido esencial, controlada y ajustada al consumo.

3. Proceso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la demanda celular se determina midiendo la 15 concentración de unos parámetros escogidos de los nutrientes y de los productos metabólicos.

4. Proceso según la reivindicación 3, caracterizado porque la concentración de glutamina se determina como magnitud de regulación.

5. Proceso según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los nutrientes también contienen aminoácidos no esenciales, vitaminas, oligoelementos, sales o/y factores de crecimiento, p.ej. insulina.

6. Proceso según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido glicolizado es EPO. 25

7. Proceso según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cultivo se efectúa a una temperatura : 35, 5ºC.