Un dispositivo de ensayo, que comprende: a) una membrana; b) al menos un péptido unido a la membrana,

comprendiendo el péptido un sustrato para una enzima producida por un microorganismo; c) una enzima señal unida al péptido; y d) al menos un sustrato marcado de forma detectable unido a la membrana en una segunda localización, siendo el sustrato marcado de forma detectable una diana de la enzima señal

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Mediante la amplificación de señales químicas, puede detectarse un proceso que experimenta una reacción química, incluso a concentraciones muy bajas. Dicho proceso de amplificación tiene la posibilidad de proporcionar una gran utilidad en cualquier campo que requiera detección sensible y/o rápida de reacciones químicas. Por ejemplo, dicho proceso podría usarse para detectar microorganismos que provocan infección y enfermedad, agentes químicos o de guerra biológica o contaminantes ambientales.

En la actualidad, no existen procedimientos que proporcionen una detección sensible y rápida de reacciones químicas. Los procedimientos actuales son demasiado lentos o no son suficientemente sensibles. Por ejemplo, algunos procedimientos de detección pueden detectar la presencia de bacterias nocivas a lo largo de unas pocas horas. Sin embargo, con frecuencia es crítico detectar patógenos en un periodo de unos pocos minutos para determinar que un paciente tendrá una infección. La capacidad de detectar la presencia de bacterias nocivas antes de la aparición de la infección permitiría que la curación de heridas y quemaduras se produjera de forma más rápida y con menos complicaciones. Además, después de dar el alta a los pacientes del hospital, éstos pasan a ser responsables de controlar sus propios cuidados sanitarios y los síntomas de la infección podrían no resultar evidentes para el paciente no experto. La rápida identificación de cepas bacterianas peligrosas permitiría la prescripción del tratamiento más apropiado y evitaría el abuso de antibióticos de amplio espectro dando como resultado consecuencias mejoradas para el paciente y una reducción en el desarrollo de cepas de bacterias resistentes a antibióticos.

Las quemaduras graves son un motivo principal para la admisión en unidades de cuidados intensivos. Actualmente, los pacientes con quemaduras totales por encima del 20% de la superficie corporal tienen una tasa de mortalidad del 22%. Aunque la terapia antimicrobiana moderna ha mejorado los resultados para pacientes con quemaduras serias, las infecciones siguen siendo una causa principal de morbilidad y mortalidad en pacientes que sobreviven a la fase de choque de una lesión térmica. A pesar de terapias de antibióticos y asepsia mejorada, con frecuencia el control de la infección no es completamente exitoso. La infección también es una de las principales causas del padecimiento del paciente, escasa curación de heridas, destrucción de tejido amplia y complicaciones locales y sistémicas serias. Por lo tanto, el control de una infección en un paciente gravemente quemado desempeña un papel importante en el pronóstico, debido a que la aparición de infecciones serias pueden conducir a la muerte del paciente, directamente o a través de mecanismos relacionados (por ejemplo, el aplazamiento de la cirugía debido a condiciones generales negativas).

Las infecciones intrahospitalarias son una preocupación seria para los hospitales, puesto que muchos pacientes son débiles o tienen el sistema inmune comprometido y son susceptibles a morbilidad y mortalidad significativas. Las tasas de colonización son significativamente más altas en el ambiente hospitalario, tanto entre trabajadores de los cuidados sanitarios como entre pacientes. Además, los organismos colonizadores en el ambiente hospitalario son probablemente resistentes a muchas formas de terapia antimicrobiana, debido a la fuerte presión selectiva que existe en el ambiente nosocomial, en el que se usan con frecuencia antibióticos. Se estima que existen más de 2 millones de infecciones adquiridas en hospitales cada año que podrían haberse evitado mediante un lavado de manos apropiado y sistemas de detección rápidos para patógenos microbianos. Estas infecciones pueden ser mortales para muchos pacientes. Por ejemplo, pacientes mayores que desarrollan una infección transmitida por la sangre debido a implantación de catéteres tienen más de una tasa de mortalidad de más del 50%. Desafortunadamente, muchos síntomas sólo resultan evidentes después de que la infección se haya establecido.

La posibilidad de que se encuentren patógenos alimentarios o transmitidos por el agua en países del tercer mundo o se liberen en un ataque de bioterrorismo es problemática debido al estado de la tecnología actual. Muchas causas habituales de enfermedad son capaces de infectar a gente muy joven o a los mayores a través de agua o comida contaminadas, incluso a concentraciones muy bajas (tan poco como de 10 a 100 células de Shigella, Salmonella o E. coli O157:H7 pueden provocar enfermedad o muerte). Un procedimiento que posibilite una detección temprana de dichos contaminantes sería beneficioso puesto que los procedimientos actuales requieren un tiempo de muestreo y recogida largos para detectar de forma apropiada la presencia e identidad de los patógenos. La detección temprana reduciría el número de retiradas de alimento e identificación escasa de marcas (por ejemplo, cuando una planta de procesado se cierra por la USDA).

En esta época de bacterias resistentes y armas biológicas, la detección e identificación rápida de patógenos humanos y toxinas biológicas es crucial para que se pueda implementar la respuesta médica más apropiada. Una detección temprana requiere algún procedimiento de amplificación de señal, puesto que los agentes biológicos pueden infectar en cantidades tan pequeñas que los agentes pueden no detectarse por otras técnicas no amplificadas. Resultaría útil tener un procedimiento de amplificación de señal que supere los sistemas de detección e identificación existentes en su velocidad y simplicidad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a zimógenos y su uso en dispositivos de detección.

La presente solicitud también describe procedimientos para detectar la modificación de un péptido. En una realización, el procedimiento comprende las etapas de exponer un zimógeno a una muestra y detectar la modificación o una ausencia de la modificación. El zimógeno incluye un péptido exógeno y una enzima señal que se inhibe por el péptido exógeno. La exposición se produce en condiciones que facilitarán una modificación del péptido exógeno. La modificación incluye escindir el péptido exógeno y la escisión da como resultado la activación de la enzima señal y una señal detectable. Algunos ejemplos de enzimas señal adecuadas incluyen proteína verde fluorescente (GFP), luciferasa, lacasa (CotA) y peroxidasa de rábano rusticano (HRP).

En un ejemplo adicional descrito en el presente documento, el procedimiento comprende las etapas de exponer una estructura a una muestra y detectar la modificación o ausencia de la modificación. La estructura incluye un péptido exógeno y al menos un cofactor. La exposición se produce en condiciones que facilitarán una modificación del péptido exógeno. La modificación incluye escindir el péptido exógeno y la escisión da como resultado que el cofactor active un zimógeno para producir una enzima señal. La escisión también dará como resultado una señal detectable.

En un ejemplo adicional descrito en el presente documento, el procedimiento comprende las etapas de exponer un péptido exógeno a una muestra y detectar la modificación o una ausencia de la modificación. El péptido exógeno se une al menos a dos enzimas y el péptido exógeno inhibe las enzimas. La exposición se produce en condiciones que facilitarán una modificación del péptido exógeno. La modificación incluye escisión del péptido exógeno y la escisión da como resultado la activación de las enzimas y una señal detectable.

En un ejemplo descrito en el presente documento, el procedimiento comprende las etapas de exponer un complejo a una muestra y detectar la modificación o una ausencia de la modificación. El complejo incluye al menos un péptido exógeno y al menos dos enzimas que se inhiben por el péptido exógeno. La exposición se produce en condiciones que facilitarán una modificación del péptido exógeno. La modificación incluye escindir el péptido exógeno y la escisión da como resultado una señal detectable.

En un ejemplo descrito en el presente documento, el procedimiento comprende las etapas de exponer un zimógeno a una muestra líquida y detectar la modificación o una ausencia de la modificación. El zimógeno incluye un péptido exógeno y una enzima señal que se inhibe por el péptido exógeno. El zimógeno se une a una superficie sólida en un punto de unión y la exposición se produce en condiciones... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo de ensayo, que comprende: a) una membrana; b) al menos un péptido unido a la membrana, comprendiendo el péptido un sustrato para una

enzima producida por un microorganismo; c) una enzima señal unida al péptido; y d) al menos un sustrato marcado de forma detectable unido a la membrana en una segunda

localización, siendo el sustrato marcado de forma detectable una diana de la enzima señal.