Un kit que comprende una placa multipocillo que contiene anticuerpos liofilizados o configurados de otra forma para un transporte y conservación convenientes,

en el que los anticuerpos son para detectar el panel de marcadores de fenotipo descritos en la Tabla 2

Campo de la invención

La presente invención se dirige a procedimientos para la determinación rápida, eficaz y precisa del fenotipo de las células. En particular, esta invención se dirige a procedimientos que emplean anticuerpos.

Antecedentes

La superficie de cada célula del organismo está recubierta de proteínas. Estas proteínas de la superficie celular tienen varias funciones. Por ejemplo, las proteínas de la superficie celular pueden ser receptores, que tienen la capacidad de unirse o adherirse selectivamente a otras moléculas de “señalización”. Alternativamente, estas proteínas pueden ser funcionales o estructurales. Por ejemplo, la proteína puede facilitar la adherencia de la célula a un sustrato, o la proteína puede facilitar la secreción de una molécula. Cada tipo celular, por ejemplo una célula hepática, tiene una determinada combinación de proteínas sobre su superficie que la hace distinguible de los otros tipos de células o sistemas celulares.

La expresión de las proteínas de la superficie celular de un tipo determinado de células puede variar, dependiendo de diversos factores. Puede incluir, por ejemplo, cambios como resultado de la proliferación y diferenciación celular, enfermedad, aislamiento de la célula del organismo y cultivo in vitro. Por ejemplo, se ha notificado que las proteínas de la superficie celular tienen funciones vitales en múltiples etapas de la metástasis del cáncer de próstata, como la separación de las células tumorales de la matriz extracelular, resistencia de las células tumorales a la apoptosis inducida por la separación, adhesión de las células tumorales a las células endoteliales y angiogénesis como apoyo al crecimiento tumoral. Puede que haya proteínas de la superficie celular expresadas de forma exclusiva o diferenciada tanto en células epiteliales como endoteliales que son importantes para los procesos individuales de la metástasis del cáncer de próstata.

Los investigadores han aprovechado la exclusividad biológica de las proteínas de la superficie celular y de propiedades celulares de determinados compuestos para etiquetas o "marcar" las células. Las células marcadas de esta forma pueden aislarse y caracterizarse fácilmente. En muchos casos, se usa una combinación de marcadores múltiples para identificar un tipo celular en particular.

Los anticuerpos se utilizan ampliamente como herramientas de diagnóstico en una amplia selección de análisis diferentes. Los anticuerpos monoclonales y recombinantes pueden utilizarse como sondas para etiquetar o marcar células. Los inmunoensayos a base de anticuerpos son el tipo de ensayo diagnóstico utilizado con mayor frecuencia y sigue siendo una de las tecnologías en más rápido crecimiento para el análisis de biomoléculas. Otro ejemplo con especial importancia en el diagnóstico que se ha convertido en rutinario durante la pasada década es el análisis por citometría de flujo. La citometría de flujo es un procedimiento para cuantificar componentes o características estructurales de las células principalmente mediante sistemas ópticos. Aunque realiza determinaciones de una célula cada vez, pueden procesarse miles de células en pocos segundos. Puesto que los diferentes tipos celulares pueden distinguirse cuantificando características estructurales, la citometría de flujo puede usarse para contar células de tipos diferentes en una mezcla. También pueden emplearse citómetros de flujo para seleccionar o "clasificar" células en base a su expresión de marcadores de la superficie celular.

Los componentes intracelulares también pueden ponerse de manifiesto mediante sondas fluorescentes, incluyendo el ADN total/célula (lo que permite el análisis del ciclo celular), el ADN recién sintetizado, secuencias de nucleótidos específicos en el ADN o ARNm, filamentos de actina y cualquier estructura para la cual se disponga de un anticuerpo. Con la citometría de flujo también se pueden controlar los cambios rápidos en el calcio libre intracelular, el potencial de membrana, el pH o las vías de señalización celular. Por ejemplo, Krutzik y col. (Journal of Immunology, 2005, 175: 2357-2365) establecen que “la citometría de flujo fosfoespecífica ha surgido como una herramienta poderosa para analizar los acontecimientos de señalización intracelular en poblaciones complejas de células debido a su capacidad para discriminar simultáneamente tipos celulares en función de la expresión de marcadores superficiales y de los niveles medidos de fosfoproteínas intracelulares. Esto ha proporcionado una introspección novedosa dentro de la naturaleza específica de la célula y de las vías de señalización inmune".

El análisis por citometría de flujo y los estudios de clasificación usando anticuerpos monoclonales para definir los marcadores superficiales en poblaciones celulares normales y neoplásicas crearon la base para los ensayos de diagnóstico clínico de rutina que ahora alcanzan desde la clasificación de la leucemia al control de la pérdida de células T CD4+ al tiempo que progresa la enfermedad por VIH.

A pesar de la versatilidad de la citometría de flujo, hay algunos inconvenientes. Por ejemplo, los anticuerpos elegidos como reactivos de citometría de flujo pueden no ser óptimos: Puede que no sean específicos, lo que produce una elevada tinción de fondo. Además, la eficacia de conjugación del fluorocromo al anticuerpo puede variar de un lote a otro. Por tanto, las comparaciones entre poblaciones de células pueden complicarse adicionalmente.

**(Ver fórmula)**

Además, para evaluar parámetros múltiples en poblaciones celulares, es necesaria una inversión importante para comprar los anticuerpos requeridos. Por ejemplo, el análisis de 90 parámetros individuales requerirá comprar los 90 anticuerpos independientes, lo que pueden ascender a varias decenas de miles de dólares y un gran número de células por análisis. Esto es problemático si el número de células es finito y limitado. Por tanto, existe una necesidad significativa de reactivos y anticuerpos rentables, validados y reproducibles para el fenotipado o análisis de células.

Rosa y col. (Nature Medicine, 7, 245 - 248, 2001) identificaron células T vírgenes humanas usando citometría de flujo.

Borowitz y col. (Blood, 89:11, 3960-3966, 1997) usaron la citometría de flujo para medir la expresión de antígeno de la superficie de la membrana en pacientes diagnosticados con leucemia linfoblástica aguda de precursores de células B.

Hamann y col. (J. Exp. Med., 186:3, 1407-1418, 1997) caracterizaron células T CD8+ humanas de memoria y efectoras usando citometría de flujo.

En el documento WO 02/074789 (Escuela de Medicina de Baylor) se caracterizaron monocitos de sangre de pacientes con VIH usando citometría de flujo.

Sumario

La presente invención proporciona un kit que comprende una placa multipocillo que contiene anticuerpos liofilizados

o configurados de otra forma para un transporte y conservación convenientes, en la que los anticuerpos son para detectar el panel de marcadores de fenotipo descritos en la Tabla 2.

La presente invención también proporciona un kit para comparar el estado fenotípico de una primera muestra de material desconocido con un material de muestra de un estado fenotípico conocido donde el material de la muestra no procede de un embrión humano que comprende:

a. el panel de marcadores fenotípicos descritos en la Tabla 2 y

b. anticuerpos para detectar la presencia de los marcadores fenotípicos de la Tabla 2 en una materia de muestra.

La presente invención también proporciona un procedimiento para comparar el estado fenotípico de un primer material de muestra desconocido con un material de muestra de un estado fenotípico conocido que comprende las etapas de:

a. Obtener un primer material de muestra desconocido y;

b. Poner en contacto el primer material de muestra desconocido con anticuerpos para detectar la presencia de los marcadores fenotípicos del panel descrito en la Tabla 2 en el primer material de muestra desconocido y

c. Registrar la presencia de marcadores fenotípicos en el primer material de muestra desconocido y;

d. Obtener un material de muestra de un estado fenotípico conocido y

e. Poner en contacto el material de muestra de un estado fenotípico conocido con dichos reactivos para detectar la presencia de dicho panel de marcadores fenotípicos donde el material de muestra no procede de un embrión humano en el... [Seguir leyendo]

1. - Un kit que comprende una placa multipocillo que contiene anticuerpos liofilizados o configurados de otra forma para un transporte y conservación convenientes, en el que los anticuerpos son para detectar el panel de marcadores de fenotipo descritos en la Tabla 2.

2. - Un kit para comparar el estado fenotípico de un primer material de muestra desconocido con un material de muestra de un estado fenotípico conocido que comprende:

a. el panel de marcadores fenotípicos descritos en la Tabla 2 y

b. anticuerpos para detectar la presencia de los marcadores fenotípicos de la Tabla 2 en un material de muestra.

3. - El kit de la reivindicación 1 o 2 en el que los anticuerpos son anticuerpos liofilizados.

4. - El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que los anticuerpos están marcados con un marcador fluorescente.

5. - Un procedimiento para comparar el estado fenotípico de un primer material de muestra desconocido con un material de muestra de un estado fenotípico conocido que comprende las etapas de:

a. Obtener un primer material de muestra desconocido y;

b. Poner en contacto el primer material de muestra desconocido con anticuerpos para detectar la presencia de los marcadores fenotípicos del panel descrito en la Tabla 2 en el primer material de la muestra desconocido y

c. Registrar la presencia de marcadores fenotípicos en el primer material de muestra desconocido y;

d. Obtener un material de muestra de un estado fenotípico conocido y

e. Poner en contacto el material de muestra de un estado fenotípico conocido con dichos reactivos para detectar la presencia de dicho panel de marcadores fenotípicos de la Tabla 2 en el material de muestra de un estado fenotípico conocido y

f. Registrar la presencia de marcadores fenotípicos en el material de muestra de un estado fenotípico conocido y

g. Notificar las diferencias entre el material de muestra desconocido y el material de muestra de un estado fenotípico conocido.

6. - El procedimiento de la reivindicación 5 para su uso con fines de control de calidad.

7. - El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o del procedimiento de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6 en el que el material de muestra son células.