LA INVENCION SE REFIERE AL USO DEL ACIDO RIBONUCLEICO (ARN) EXTRACELULAR DERIVADO O ASOCIADO CON UN TUMOR ENCONTRADO EN CIRCULACION EN LA FRACCION DE PLASMA O DE SUERO DE LA SANGRE PARA LA DETECCION,

MONITORIZACION O EVALUACION DEL CANCER EN CONDICIONES PREMALIGNAS. EL ARN EXTRACELULAR PUEDE CIRCULAR COMO ARN NO UNIDO, ARN UNIDO A PROTEINAS, COMPLEJOS DE LIPIDOARN, COMPLEJOS DE LIPOPROTEINAS (PROTEOLIPIDOS-ARN), COMPLEJOS DE PROTEINAS-ARN QUE INCLUYEN EN SU INTERIOR O ESTAN ASOCIADOS CON COMPLEJOS DE RIBONUCLEOPROTEINAS, NUCLEOSOMAS O EN EL INTERIOR DE CUERPOS APOPTOTICOS. CUALQUIER ARN ENCONTRADO EN EL PLASMA O EN EL SUERO PUEDE DETECTARSE ADICIONALMENTE MEDIANTE LA INVENCION. ESPECIFICAMENTE, ESTA INVENCION HACE POSIBLE LA EXTRACCION DEL ARN CIRCULANTE DEL PLASMA O DEL SUERO Y UTILIZA ENSAYOS DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICO PARA LA IDENTIFICACION, DETECCION, INTERFERENCIA, MONITORIZACION O EVALUACION DE CUALQUIER NEOPLASMA BENIGNO, PREMALIGNO O MALIGNO EN HUMANOS U OTROS ANIMALES, QUEPODRIA ESTAR ASOCIADO CON ESE ARN. ADEMAS, LA INVENCION PERMITE LA DETECCION CUALITATIVA O CUANTITATIVA DEL ARN EXTRACELULAR DERIVADO O ASOCIADO CON TUMORES QUE CIRCULA EN EL PLASMA O EN EL SUERO DE HUMANOS O ANIMALES CON O SIN NINGUN CONOCIMIENTO PREVIO DE LA PRESENCIA DEL CANCER O DE TEJIDOS PREMALIGNOS

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El ácido ribonucleico (RNA) es esencial en los procesos que permiten la traducción del código genético para formar proteínas, necesarias para todas las funciones celulares, tanto en células normales como neoplásicas. Aunque el código genético existe estructuralmente como ácido desoxirribonucleico (DNA), es la función del RNA, que existe como los subtipos RNA de transferencia, RNA mensajero o RNA similar al mensajero y RNA ribosómico, la que transporta y traduce este código a los sitios celulares de la producción de proteínas. En el núcleo, este RNA puede existir además como ribonucleoproteínas (RNP) o en asociación con ellas. La patogénesis y regulación del cáncer depende de la traducción mediada por el RNA de códigos genéticos específicos, que con frecuencia reflejan los eventos mutacionales dentro de los oncogenes, para producir las proteínas implicadas en la proliferación, regulación y muerte celular. Además, otros RNA y sus proteínas traducidas, aunque no necesariamente las implicadas en la patogénesis o regulación neoplásica, pueden servir para definir las características reconocibles de neoplasmas particulares al ser expresadas elevada o in-apropiadamente. Así, el reconocimiento del RNA específico puede permitir la identificación, detección, interferencia, monitorización o evaluación de cualquier neoplasma, benigno, maligno o pre-maligno, en seres humanos y animales. Por otra parte, puesto que el RNA puede ser creado repetidamente a partir de su molde de DNA, para un gen dado dentro de una célula, puede formarse un número sustancialmente mayor de moléculas de RNA asociadas que de moléculas de DNA. Por consiguiente, un ensayo basado en el RNA debe tener mayor sensibilidad y mayor utilidad clínica que un ensayo correspondiente basado en el DNA. Obsérvese que el término RNA significa ácido ribonucleico incluyendo los fragmentos de ácido ribonucleico que consisten en secuencias de ácido ribonucleico.

Los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos basados en el RNA, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (abreviadamente en lo sucesivo RT-PCR por sus iniciales en inglés reverse transcriptase polymerase chain reaction), también conocida como reacción en cadena de la polimerasa por transcripción inversa o RNA-PCR), amplificación de la señal de DNA ramificado y ensayos de replicación de secuencias auto-sostenible, tal como la amplificación isoterma basada en secuencias de ácidos nucleicos (abreviadamente en lo sucesivo NASBA por la expresión inglesa nucleic acid sequence based amplification), han demostrado ser métodos altamente sensibles y específicos para detectar pequeños números de moléculas de RNA. Como tales, pueden usarse en ensayos directos de tejido neoplásico (1-3). Puesto que la sangre periférica se obtiene fácilmente de pacientes con cáncer y se sabe que las células cancerosas metastásicas circulan en la sangre de pacientes con cáncer avanzado, varios investigadores han usado recientemente la RTPCR para detectar el RNA intracelular extraído de células cancerosas circulantes (47). Debe resaltarse que actualmente los investigadores aplican la RT-PCR para detectar el RNA intracelular extraído de una fracción predominantemente celular de sangre con el fin de demostrar la existencia de células cancerosas circulantes. La RT-PCR se aplica únicamente a la fracción celular de sangre obtenida de pacientes con cáncer, es decir, el sedimento celular o las células de la sangre completa. Antes del ensayo se desecha generalmente el plasma o fracción de suero de la sangre, que no se examina por separado. Puesto que dicho método de fracción celular se basa en la presencia de células cancerosas circulantes metastásicas, tiene un uso clínico limitado en pacientes con cánceres tempranos y no es útil en la detección de neoplasmas no invasivos o estados pre-maligno.

La invención descrita por esta solicitud de patente demuestra el uso nuevo del RNA, derivado de un tumor o asociado a un tumor de seres humanos o animales, encontrado circulando en el plasma o fracción de suero de la sangre, como medio para detectar, monitorizar o evaluar el cáncer y estados pre-malignos. Esta invención se basa en la aplicación de técnicas de extracción del RNA y ensayo de amplificación de ácidos nucleicos para detectar el RNA extracelular derivado de un tumor o asociado a un tumor que se encuentra circulando en el plasma o suero. En contraste con la detección del RNA relacionado con virus en plasma o suero y la detección del DNA asociado a tumores en plasma y suero, la detección del RNA humano o de mamíferos y particularmente el RNA derivado de, o asociado a un tumor, nunca ha sido detectado específicamente en el plasma o fracción de suero de la sangre usando una metodología de amplificación de ácidos nucleicos y por consiguiente representa un uso nuevo y no obvio de estos métodos de extracción de RNA y de estos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos. Puesto que esta invención no depende de la presencia de células cancerosas circulantes, es clínicamente aplicable a casos de cáncer temprano, cánceres no invasivos y estados pre-malignos, además de casos de cáncer invasivo y cáncer avanzado. Además, esta invención permite la detección de RNA en plasma y suero previamente congelado o conservado de cualquier otra forma, pudiendo así disponer para el análisis de los bancos de plasma y suero y aumentando por tanto su utilidad general.

El RNA derivado de un tumor o asociado a un tumor que está presente en el plasma y el suero puede existir en dos formas. La primera RNA extracelular y la segunda RNA intracelular extraíble de células que contaminan ocasionalmente el plasma

o la fracción de suero. En la práctica, no es necesario diferenciar entre la forma intracelular y extracelular para detectar el RNA en el plasma o suero utilizando la invención y por tanto esta invención puede usarse para la detección de ambas formas. Los usos potenciales del RNA extracelular derivado de, o asociado a un tumor, no han sido obvios para la comunidad científica ni tampoco la aplicación de ensayos de amplificación de ácidos nucleicos para detectar el RNA extracelular derivado de, o asociado a, un tumor. En realidad, la propia existencia de RNA extracelular derivado de, o asociado a, un tumor no ha sido obvio para la comunidad científica y generalmente se considera que no existe. En general se cree que las ribonucleasas del plasma degradan rápidamente cualquier RNA extracelular de mamífero que pudiera circular en la sangre, no pudiendo ser detectado (8). Komeda et al., por ejemplo, añadieron específicamente RNA libre a sangre completa obtenida de voluntarios normales, pero no pudieron detectar dicho RNA usando la PCR (54). Sin embargo, las nucleasas aparecen inhibidas en el plasma de los pacientes con cáncer (9). Además, el RNA extracelular, formando complejos con lípidos y proteolípidos, unido a proteínas o dentro de cuerpos apoptósicos, estaría protegido de las ribonucleasas. De este modo, aunque todavía sin definir, el RNA extracelular derivado de, a o asociado a, un tumor puede estar presente en el plasma o suero por medio de diversos mecanismos. El RNA extracelular podría ser segregado o diseminado por el tumor en forma de complejos de lipoproteínas (proteolípido)-RNA o lípido-RNA, podría encontrarse en los cuerpos apoptósicos circulantes derivados de las células tumorales apoptósicas, podría encontrarse en complejos de proteo-RNA liberados de células viables o moribundas que incluyen, o están asociadas a, ribonucleoproteínas o asociadas a otras proteínas, tal como galactina-3, o el RNA podría ser liberado por células necrósicas y circular luego unido a proteínas normalmente presentes en el plasma. Adicionalmente, podría existir circulando en complejos de RNA-DNA incluyendo los asociados a ribonucleoproteínas y otros RNA nucleicos. Además, el RNA puede existir simultáneamente en varios de estos restos. Por ejemplo, el RNA puede encontrarse asociado a la ribonucleoproteína encontrada en los cuerpos apoptósicos proteolípidos. La presencia de RNA extracelular en el plasma o suero hace factible su detección por ensayo de amplificación de ácidos nucleicos.

Diversos estudios en la bibliografía respaldan la existencia del RNA extracelular derivado de, o asociado a, un tumor. Se ha demostrado que el RNA está presente en la superficie celular de las células tumorales, por electroforesis (10), preparaciones de membranas (11) y liberación de P32 (12). La pérdida de vesículas de fosfolípidos por las células tumorales es un fenómeno bien descrito (13,14) y se ha demostrado que vesículas similares...

1. Un método de detectar RNA extracelular de mamífero derivado de un tumor

o asociado a un tumor en la fracción de plasma o suero de sangre un ser humano o un animal como ayuda en la detección, diagnosis, monitorización, tratamiento o evaluación de enfermedades neoplásicas, incluyendo cáncer, cánceres no invasivos, estados premalignos, cáncer invasivo, cáncer avanzado y neoplasmas benignos, estando dicho método caracterizado por las etapas siguientes:

a) extraer el RNA total del mamífero del plasma o suero de un ser humano o animal, una parte del cual comprende RNA extracelular de mamífero derivado de un tumor o asociado a un tumor; b) amplificar el RNA extracelular de mamífero extraído derivado de un tumor o asociado a un tumor o su correspondiente DNA, de un modo cualitativo o cuantitativo; y c) detectar el RNA amplificado o su correspondiente cDNA, de un modo cualitativo o cuantitativo.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el RNA procede del plasma o suero de un ser humano con adenoma o displasia.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el RNA extracelular de mamífero asociado a un tumor o derivado de un tumor se extrae de plasma o suero usando un método de extracción de RNA seleccionado de:

a) método de extracción en gelatina; b) método de extracción en sílice, bolas de vidrio o en diatomeas; c) método de extracción con reactivo TRI o similar, tal como TRlsolv, TRlsol or

ISOGEN; d) métodos de extracción basados en solución ácida de tiocianato de guanidinio; e) centrifugación a través de un gradiente de cloruro de cesio o similar; y f) métodos de extracción basados en fenol-cloroformo.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque una parte del RNA total extraído es RNA de mamífero, seleccionado de:

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la amplificación se realiza por un método de amplificación de RNA, incluyendo aquellos en los que el RNA se somete a transcripción inversa a cDNA, y en los cuales se amplifica el cDNA, por un método seleccionado de los siguientes:

a) reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa; b) reacción en cadena de la ligasa; c) amplificación de señal de DNA ramificado; d) reporteros de RNA amplificable; e) replicación Q-beta; f) amplificación basada en transcripción; g) amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos isotermas (NASBA); h) cualquiera de otros ensayos de replicación de secuencias auto-sostenible; i) amplificación de DNA bumerán; j) activación por desplazamiento de cadenas; k) tecnología de sondas cíclicas ; y l) cualquier combinación o variación de las anteriores.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque los cebadores empleados en el ensayo de amplificación se seleccionan para un RNA específico derivado de tumor o asociado a tumor o cDNA derivado del mismo, que caracterizan un tumor, y en donde dicho RNA se selecciona:

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque los cebadores empleados en el ensayo de amplificación pueden ser opcionalmente ceba-dores anidados o semi-anidados.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque las sondas empleadas en el ensayo de amplificación se seleccionan para un RNA específico derivado de un tumor o asociado a un tumor o cDNA derivado del mismo, que caracterizan un tumor, y en donde dichos RNA se seleccionan de:

a) mRNA de tirosinasa; b) mRNA de queratina 19; c) mRNA de p97; d) mRNA de MUC 18; e) mRNA de CD44; f) mRNA de MARGE-1; g) mRNA de MAGE-2; h) mRNA de MANGE-3;

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la detección del RNA o cDNA amplificado se realiza por al menos un método de detección seleccionado del grupo que consiste en: a) mRNA de tirosinasa; b) mRNA de queratina 19; c) mRNA de p97; d) mRNA de MUC 18; e) mRNA de CD44; f) mRNA de MARGE-1; g) mRNA de MAGE-2; h) mRNA de MANGE-3; i) mRNA de MAGE-4; j) mRNA de beta-gonadotropina coriónica humana (º HCG); k) RNA asociado a telomerasa; y 1) sus mezclas. a) mRNA de tirosinasa; b) mRNA de queratina 19; c) mRNA de p97; d) mRNA de MUC 18; e) mRNA de CD44; f) mRNA de MARGE-1; g) mRNA de MAGE-2; h) mRNA de MANGE-3; i) mRNA de MAGE-4; j) mRNA de beta-gonadotropina coriónica humana (º HCG); k) RNA asociado a telomerasa; y l) sus mezclas. i) mRNA de MAGE-4; j) mRNA de beta-gonadotropina coriónica humana (º HCG); k) RNA asociado a telomerasa; y l) sus mezclas.

a) electroforesis en gel;

b) detección por ensayo ELISA, incluyendo sus modificaciones, incluyendo cebadores biotinilados o modificados de otro modo, y métodos de detección inmunológicos que usan anticuerpos monoclonales;

c) sonda marcada fluorescente o cromógena; d) análisis por transferencia Southern; e) electroquimioluminescencia; f) detección por transferencia de mancha inversa; y g) cromatografía de líquidos de alta resolución.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque un ser humano se somete a escrutinio para detectar malignidad o premalignidad y en donde de la presencia de RNA extracelular de mamífero asociado a un tumor en el plasma o suero de dicho ser humano se deduce la presencia de células malignas o premalignas en el cuerpo de dicho ser humano.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque el ser humano sometido a escrutinio tiene un riesgo de malignidad que es desconocido o no sospechado.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde el método se usa para evaluar el progreso de las células pre-malignas con respecto a los fenotipos o genotipos que están caracterizados por mayor potencial maligno en los cuales

a) el método se emplea de un modo en serie; b) el plasma o suero se evalúa en cuanto a la presencia de RNA extracelular de mamífero asociado a un tumor del cual se sabe que el RNA intracelular correspondiente de dicho RNA está asociado con un potencial maligno aumentado de una célula cuando se encuentra dentro de esa célula; y c) han de estar presentes células inferentes de potencial maligno aumentado cuando dicho RNA de mamífero asociado a tumor se detecta en el plasma o suero.

13. El producto de amplificación de RNA extracelular de mamífero asociado a un tumor o RNA derivado de un tumor extraído de plasma o suero, o cDNA derivado de dichos RNA, como una composición, que incluye secuencias de ácidos nucleicos idénticas o sustancialmente idénticas a dichos RNA o sus fragmentos, o un cDNA correspondiente, que se produce por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Un método de monitorizar o evaluar un ser humano o animal respecto a una enfermedad maligna o premaligna, estando caracterizado el método por las etapas de:

a) analizar el RNA extracelular de mamífero derivado de un tumor o asociado a un tumor en el plasma o suero de un ser humano o animal por;

1) extraer el RNA total del plasma o suero de un ser humano o animal, una parte del cual comprende RNA extracelular de mamífero derivado de un tumo o asociado a un tumor; 2) amplificar el RNA derivado de un tumor o asociado a un tumor o su cDNA correspondiente de un modo cualitativo o cuantitativo; 3) detectar la presencia o ausencia del RNA o su correspondiente cDNA amplificado de un modo cualitativo o cuantitativo; y

b) opcionalmente repetir el ensayo de la etapa a) de un modo en serie.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque se proporciona un método para:

a) evaluar la respuesta a la terapia, tal como terapia quirúrgica, quimioterapia, terapia por radiación, terapia hormonal, inmunoterapia o bioterapia; b) indicar y medir el progreso de la enfermedad; c) indicar y medir la recaída de la enfermedad; d) indicar y predecir el pronóstico; e) indicar y medir la enfermedad residual; f) determinar la necesidad de terapia adicional, o evaluar el beneficio de la terapia o evaluar la necesidad de cambiar la terapia.

16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el RNA o cDNA de mamífero amplificado de la subparte (b) puede ser caracterizado adicionalmente por uno o más de los siguientes métodos:

a) secuenciación de ácidos nucleicos; b) espectroscopía; c) análisis inmunológico; d) análisis bioquímico; e) producción del RNA correspondiente; o f) producción de la proteína correspondiente.

17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como ayuda en el diseño del programa de tratamiento de un paciente, incluyendo la asignación o desarrollo de terapias específicas de tumores, incluyendo terapia vacunal, terapia con anticuerpos monoclonales y terapia antisentido.

18. Un método de someter a transcripción inversa RNA extracelular de mamífero extraído de plasma o suero de un ser humano sin cáncer, en donde se produce el cDNA correspondiente al RNA extracelular de mamífero, caracterizado porque dicho cDNA puede ser además:

a) amplificado; b) secuenciado; c) clonado; d) transcrito; e) usado en una construcción genética recombinante; o

f) manipulado de otro modo.

19. Un método en donde RNA extracelular de mamífero asociado a un tumor

o RNA extracelular de mamífero derivado de un tumor, o un cDNA correspondiente, se amplifica de modo que permita la secuenciación de dicho RNA o su correspondiente cDNA de modo que se obtenga la secuencia de ácido nucleico, estando caracterizado el método por la etapas de:

a) extraer el RNA total de plasma o suero de un ser humano o animal, en donde una porción del RNA extraído comprende RNA extracelular de mamífero derivado de un tumor o RNA asociado a un tumor; b) amplificar el RNA extracelular de mamífero extraído o un cDNA correspondiente; y c) secuenciar el RNA o cDNA amplificado.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque:

a) se determina la secuencia de ácido nucleico del RNA extracelular de mamífero asociada a un tumor o su cDNA correspondiente; b) se preparan compuestos antisentido, incluyendo oligodesoxi-nucleótidos sintéticos, basados en dicha secuencia de ácido nucleico, y c) opcionalmente, dichos compuestos antisentido se usan terapéuticamente.

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico idéntica o sustancialmente idéntica al RNA extracelular de mamífero o sus fragmentos o un cDNA correspondiente, identifica un tratamiento para un ser humano o animal.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que se aplica a la detección de múltiples especies de RNA extracelular de mamífero asociadas a un tumor en plasma o suero, estando caracterizado el método por las etapas de:

a) extraer múltiples especies de RNA extracelular de mamífero derivadas de un tumor o asociadas a un tumor de plasma o suero; b) amplificar las especies de RNA extracelular de mamífero o sus cDNA de un modo cualitativo o cuantitativo; y c) detectar el RNA o su cDNA amplificado de un modo cualitativo o cuantitativo.

23. Un método de detectar una especie de RNA extracelular de mamífero en el plasma o suero de un ser humano sin cáncer, estando caracterizado el método por las etapas de:

a) extraer el RNA extracelular de mamífero total del plasma o suero de un ser humano sin cáncer, en donde una parte de dicho RNA total de mamífero extraído contiene una especie de RNA de mamífero; b) amplificar una parte del RNA extracelular de mamífero extraído para la especie de RNA de mamífero, o cDNA derivado del mismo; y c) detectar el RNA amplificado o el cDNA correspondiente.

24. Un método de detectar RNA extracelular de mamífero en la fracción de suero o plasma de la sangre de un ser humano, en donde el RNA de mamífero es una especie de RNA de un gen translocalizado, estando caracterizado el método por las etapas de::

a) extraer el RNA total de mamífero del plasma o suero de un ser humano, en donde una parte del RNA extraído comprende una especie de RNA extracelular de mamífero de un gen translocalizado; b) amplificar el RNA extracelular de mamífero extraído que comprende una especie de RNA de un gen translocalizado, o cDNA derivado del mismo; y c) detectar el RNA amplificado o el cDNa correspondiente.

25. Un método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde una parte del RNA total de mamífero extraído es una especie de RNA seleccionada de:

a) mRNA de BCR/abl; b) mRNA de PML/RAR-º; c) mRNA de EWS/FLI-1; d) mRNA de EWS/EKG; e) mRNA de AML1/ETO.