MARCADORES MICROSATELITES DE REPETICIONES MONONUCLEOTIDO PARA DETECTAR LA INESTABILIDAD DE LOS MICROSATELITES.

Método para evaluar la inestabilidad de los microsatélites asociada con un tumor,

mediante amplificación de los loci del microsatélite en una muestra biológica que comprende ADN genómico de dicho tumor y determinación de los tamaños de los productos de amplificación del ADN, caracterizado porque dicho método comprende la amplificación de un locus del microsatélite denominado NR21, definido como una repetición 21T situada en la región no traducida 5'' del gen SLC7A8 (secuencia de ADNc GenBank XM_033393)

Marcadores microsatélites de repeticiones mononucleótido para detectar la inestabilidad de los microsatélites.

La invención se refiere a nuevos marcadores microsatélites y su uso para la detección de la inestabilidad de los microsatélites (MSI) asociada con algunos tumores.

Los microsatélites son motivos de ADN cortos (1-10 pares de bases), que se dan como repeticiones en tándem en numerosos loci por todo el genoma.

El fenotipo de inestabilidad de microsatélite (MSI) se define como la presencia en ADN tumoral de microsatélites de tamaño alternativo que no se ven en el ADN germinal correspondiente (AALTONEN et. al., Science, 260(5109), 812-816, 1.993; IONOV et. al., Nature, 363(6429), 558-561, 1.993; THIBODEAU et. al., Science, 260(5109), 816-819, 1.993; IACOPETTA et. al., Hum. Mutat., 12(5), 355-360, 1.998).

El fenotipo MSI es una característica del síndrome de cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC), en el que puede detectarse en más del 90% de todos los tumores HNPCC (LIU et. al., Nature Med., 2, 169-174, 1.996); también se da en aproximadamente el 15% de los tumores gástricos y de colon esporádicos. También se ha detectado en otros tumores, como los carcinomas pancreáticos (HAN et. al., Cancer Res., 53, 5087-5089, 1.993), carcinomas de próstata (GAO et. al., Oncogene, 9, 2999-3003, 1.994), carcinomas del endometrio (RISINGER et. al., Cancer Res., 53, 5100-5103, 1.993; PELTOMAKI et. al., Cancer Res., 53, 5853-5855, 1.993).

La MSI refleja un defecto de la reparación de apareamientos incorrectos (MMR) subyacentes que no reconoce los errores introducidos durante la replicación de las secuencias microsatélite. En el síndrome del cáncer familiar HNPCC, el fenotipo MSI es causado por mutaciones germinales en los genes hMSH2, hMLH1 de reparación de apareamientos incorrectos (MMR) y menos frecuentemente en hPMS1, hPMS2 y hPMS6 (KINZLER et. al., Cell, 87, 159-170, 1.996). En los cánceres esporádicos a menudo suele ser causado por metilación del promotor hMLH1 que lleva al silenciamiento transcripcional de este gen (HERMAN et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(12), 6870-6875, 1.998).

Los tumores gástricos y de colon MSI tienen unos perfiles clinicopatológicos y moleculares distintivos y a menudo suelen asociarse con una prognosis favorable ((LOTHE et. al., Cancer Res., 53, 5849-5852, 1.993; KIM et. al., Am. J. Pathol., 145, 148-156, 1.994; OLIVEIRA et. al., Am. J. Pathol., 153, 1211-1219, 1.998). También existe evidencia que sugiere que los pacientes de cáncer colorrectal con tumores MSI muestran un buen beneficio de supervivencia de la quimioterapia basada en 5FU (ELSALEH et. al., The Lancet, 355, 1745-1750, 2.000; LIANG et. al., Int. J. Cancer, 101, 519-525, 2.002) y por tanto la MSI podría resultar un marcador predictivo molecular útil para responder a este tipo de terapia adyuvante. El análisis de rutina del estado MSI también tiene una aplicación clínica para ayudar en el diagnóstico de casos de HNPCC sospechosos (AALTONEN et. al., N. Eng. J. Med., 338, 1481-1487, 1.998). De hecho, los tumores de pacientes HNPCC carecen de las características fenotípicas que los distinguen fácilmente de tumores esporádicos y por tanto el diagnóstico de esta enfermedad se basó históricamente en la historia familiar del cáncer utilizando por ejemplo el criterio de Ámsterdam (VASEN et. al., Dis. Colon Rectum, 34, 424-425, 1.991; VASEN et. al., Gastroenterology, 115, 1453-1456, 1.999). Tales criterios resultan sin embargo demasiado restrictivos e identifican sólo una fracción de familias HNPCC de manera que no se conoce la incidencia verdadera de esta enfermedad y las estimaciones varían desde el 0,5 hasta el 13%. Dado que los portadores familiares de defectos MMR tienen un riesgo mayor del 80% de desarrollar cáncer, resulta importante idear maneras eficaces y rentables de detectar esta condición. Con este fin, se están desarrollando en la actualidad métodos de laboratorio basados en moléculas que pueden ayudar a establecer el diagnóstico de HNPCC. Se proponen en general dos métodos: genotipificación de microsatélites e inmunohistoquímica de las proteínas de reparación de apareamientos incorrectos principales. El uso de uno u otro, o ambos métodos todavía es una cuestión de debate, basada en su coste, especificidad y eficacia relativos (LINDOR et. al., J. Clin. Oncol., 20, 1043-1048, 2.002; WAHLBERG et. al., Cancer Res., 62, 3485-3492, 2.002; TERDIMAN et. al., Gastroenterology, 120, 21-30, 2.001; LOUKOLA et. al., Cancer Res., 61, 4545-4549, 2.001). Por ahora parece que la genotipificación de microsatélites tiene una mayor sensibilidad que la IHC, pero es más cara y más difícil de configurar en laboratorios de rutina. Por tanto resulta importante desarrollar métodos simples y precisos para determinar los tumores MSI para las informaciones de diagnóstico-pronóstico y predisposición.

Los investigadores han estudiado numerosos microsatélites diferentes con el objetivo de identificar tumores MSI.

Dependiendo del tipo y número de microsatélites analizados, se han publicado resultados muy variables de frecuencia de MSI en tipos de tumores diferentes (PERUCHO, Cancer Res., 59(1), 249-256, 1.999).

Se ha propuesto el uso de una combinación de marcadores BAT-25 y BAT-26 para la detección de MSI (ZHOU et. al., Genes, Chromosomes & Cancer, 21(2), 101-107, 1.998; HOANG et. al., Cancer Res., 57(2), 300-303, 1.997).

El BAT-25 y BAT-26 son repeticiones de mononucleótidos situados respectivamente en el intrón 16 de c-kit y el intrón 5 de hMSH2. Estas dos repeticiones son cuasimonomórficas en las poblaciones caucásicas (HOANG et. al., Cancer Res., 57(2), 300-303, 1.997; ZHOU et. al., Oncogene, 15(14), 1713-1718, 1.997). Esta propiedad permite una clasificación rápida de las variaciones de tamaño alélicas grandes vistas en el ADN tumoral MSI debidas a una alteración somática. En la gran mayoría de los tumores, el análisis de BAT-25 y BAT-26 resulta suficiente para establecer su estado MSI sin referencia al ADN germinal (ZHOU et. al., Genes, Chromosomes & Cancer, 21(2), 101-107, 1.998).

Sin embargo, se han identificado los alelos de BAT-25 y BAT-26 de tamaño alternativo en 18,4 y 12,6%, respectivamente, de americanos africanos (PYATT et. al., Am. J. Pathol., 155(2), 349-353, 1.999; SAMOWITZ et. al., Am. J. Pathol., 154(6), 1637-1641, 1.999). De esta manera, puede necesitarse el análisis de repeticiones adicionales para evitar el resultado de falsos positivos ocasionales que surgen de estos polimorfismos germinales.

Por consiguiente se ha propuesto completar el análisis de repeticiones de mononucleótidos mediante el análisis adicional de repeticiones de dinucleótidos tanto en el tumor como en el ADN germinal.

Por ejemplo, la patente US 6.150.100 propone el uso de 2 repeticiones de mononucleótidos seleccionados de entre BAT25, BAT26 y BAT40, asociadas con 2 ó 3 repeticiones de dinucleótidos seleccionados de entre APC, Mfd15, D2S123, y D18S69, y opcionalmente con la repetición de pentanucleótidos TP53Alu. Las combinaciones mencionadas de marcadores microsatélites descritos en la patente US 6.150.100 son BAT25, BAT26, APC, Mfd15 y D2S123 ó BAT26, BAT40, APC, Mfd15 y D2S123.

En 1.997 una reunión de consenso internacional sobre la detección de MSI recomendó un panel de cinco marcadores para el análisis uniforme del estado MSI (BOLAND et. al., Cancer Res., 58(22), 5248-5257, 1.998). Esto incluía dos repeticiones de mononucleótidos (BAT-25 y BAT-26) y tres repeticiones de dinucleótidos (D5S346, D2S123 y D17S250). Los tumores con inestabilidad en dos o más de estos marcadores se definieron como MSI-H. Los tumores con inestabilidad en un marcador, y sin inestabilidad se definieron como MSI-L y MSS respectivamente. Los cánceres MSI-H tienen unas características clinicopatológicas distintas de los tumores MSI-L y MSS.

Algunas de las características de las repeticiones de dinucleótidos hacen su uso como marcadores del estado MSI un tanto problemático. Las repeticiones de dinucleótidos en los paneles anteriormente indicados muestran generalmente inestabilidad en sólo el 60-80% de los tumores MSI-H (SUTTER et. al., Mol. Cell Probes, 13(2), 157-165, 1.999). Existe alguna evidencia para sugerir que la pérdida de MMR y la posterior alteración de las repeticiones de mononucleótidos sucede más temprano en...

1. Método para evaluar la inestabilidad de los microsatélites asociada con un tumor, mediante amplificación de los loci del microsatélite en una muestra biológica que comprende ADN genómico de dicho tumor y determinación de los tamaños de los productos de amplificación del ADN, caracterizado porque dicho método comprende la amplificación de un locus del microsatélite denominado NR21, definido como una repetición 21T situada en la región no traducida 5' del gen SLC7A8 (secuencia de ADNc GenBank XM_033393).

2. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende adicionalmente la amplificación de un segundo locus del microsatélite denominado NR24, definido como una repetición 24T situada en la región no traducida 3' del gen dedo de cinc-2 (secuencia de ADNc GenBank X60152), y la amplificación de un tercer locus del microsatélite seleccionado de entre:

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque comprende adicionalmente la amplificación de por lo menos un locus de repetición mononucleótido seleccionado entre BAT-25 y BAT-26.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque comprende la amplificación de los cuatro loci del microsatélite BAT-25, BAT-26, NR21, NR24, y la amplificación de un quinto locus del microsatélite seleccionado de entre NR22 y NR27.

5. Uso de un par de cebadores adecuados para la amplificación del locus NR21 del microsatélite, definido como una repetición 21T situada en la región no traducida 5' del gen SLC7A8, para evaluar in vitro la inestabilidad de microsatélite asociada con un tumor.

6. Uso de la reivindicación 5 en el que dicho par de cebadores se selecciona de entre:

7. Kit para el análisis de la inestabilidad de microsatélite, caracterizado porque comprende por lo menos un par de cebadores como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, y un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR24.

8. Kit según la reivindicación 7, caracterizado porque comprende adicionalmente un par de cebadores seleccionados de entre:

9. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque comprende adicionalmente por lo menos un par de cebadores seleccionados de entre:

10. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 9, caracterizado porque el par de cebadores adecuados para la amplificación de NR24 consiste en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 8 y SEQ ID Nº: 9.

11. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque:

12. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque:

13. Método para el diagnóstico del fenotipo MSI-H de un tumor, en el que dicho método comprende evaluar la inestabilidad de microsatélite de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Método según la reivindicación 13 en el que dicho tumor es un tumor del tracto gastrointestinal.

15. Método según la reivindicación 13 en el que dicho tumor es un tumor gástrico o colorrectal.

16. Método según la reivindicación 13 en el que dicho tumor es un tumor del endometrio.