Un método para detectar una alteración en un ácido nucleico diana que se sospecha que está en una muestra biológica,

comprendiendo el método las etapas de: a) añadir, a una muestra biológica que se sospecha que contiene un ácido nucleico diana, una pluralidad de ácidos péptido-nucleicos monocatenarios que hibridan de forma contigua con una región de dicho ácido nucleico diana si dicha región está inalterada; b) añadir a dicha muestra biológica una agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios; y, c) detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana como la presencia de un producto de degradación de las etapas a) y b) resultante de la degradación dentro de dicha región de dicho ácido nucleico diana

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere en líneas generales a métodos para detectar una alteración en un ácido nucleico diana.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Muchas enfermedades están asociadas con la inestabilidad genómica. Por tanto, se han propuesto marcadores de inestabilidad como agentes de diagnóstico. Por ejemplo, las mutaciones se consideran marcadores valiosos para una diversidad de enfermedades, y han formado la base para los ensayos de exploración. Las mutaciones específicas pueden ser una base para ensayos de exploración molecular para las fases tempranas de ciertos tipos de cáncer. Véase, por ejemplo, Sidransky, et al., Science, 256:102-105 (1992). Por ejemplo, las mutaciones en los genes BRCA se han propuestos como marcadores para cáncer de mama, y las mutaciones en el gen regulador del ciclo celular p53 se han asociado con el desarrollo de numerosos tipos de cánceres.

La detección temprana de una alteración permite el diagnóstico temprano de una enfermedad, y por tanto también proporciona una opción para la intervención antes de la presentación de los síntomas de la enfermedad que a menudo suceden después de la metástasis cuando se puede obtener menos fácilmente una cura. Sin embargo, la detección de mutaciones genéticas u otras alteraciones es difícil, o imposible, en ciertos tipos de muestra. Por ejemplo, la dificultada de aislar ADN de muestras heterogéneas, complejas hace difícil la identificación de una mutación en fase temprana.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de métodos eficaces para determinar la presencia o ausencia de ciertas mutaciones genéticas u otras alteraciones en un ácido nucleico diana en una muestra biológica.

El documento US 6.051.378 se refiere a métodos para explorar ácidos nucleicos para mutaciones analizando ácidos nucleicos fragmentados no aleatoriamente usando técnicas de espectrometría de masas y a procedimientos para mejorar la resolución de masas y la precisión de masas de estos métodos.

Shenk et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1975, vol. 72, nº 3, marzo de 1975, páginas 989-993 se refiere a un método bioquímico para mapear alteraciones mutacionales en ADN con nucleasa S1.

Seitz et al. Chem. Eur. J. US, vol. 7, nº 18, 17 de septiembre de 2001 (2001-0917), páginas 3911-3925 se refiere a estrategias para la unión de grupos informadores fluorescentes a ácidos péptido-nucleicos en solución y en fase sólida.

Brookes et al. (1989) Eur. J. Biochem., vol. 183, nº 2 se refiere a la evaluación del uso de la nucleasa S1 para detectar variaciones de pequeña longitud en ADN

genómico.

El documento WO99/19517 se refiere al análisis de ADN mellado por cromatografía de polinucleótidos iónicos apareados.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona métodos para detectar una alteración en un ácido nucleico diana en una muestra biológica. De acuerdo con la invención, se expone una pluralidad de sondas de ácido nucleico monocatenario o ácido péptido-nucleico complementarias a una región contigua del ácido nucleico diana, si dicha región está inalterada, a una muestra biológica que se sospecha que contiene la diana. El método comprende adicionalmente añadir a dicha muestra biológica un agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios; y detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana así como la presencia de un producto de degradación resultante de la degradación dentro de dicha región de dicho ácido nucleico diana. Se diseñan sondas para que hibriden con la diana de un modo contiguo para formar un dúplex que comprende la diana y las sondas contiguas "adosadas" a lo largo de la diana. Un ejemplo de este dúplex se muestra en la Figura 1. Si existe una mutación u otra alteración en la diana, se interrumpirá el adosado contiguo, produciendo regiones monocatenarias de la diana en las que no existe dúplex. Esto se muestra en la Figura

2. La identificación de una o más regiones monocatenarias en la diana es indicativa de una mutación u otra alteración en la diana que evitó la hibridación de la sonda en esa región. Para propósitos de la presente invención, una "secuencia adosada" o "adosado" se refiere a la hibridación contigua de sondas con una región diana, estén separadas por secuencia monocatenaria o no.

Por consiguiente, en métodos de la invención, se expone una muestra que comprende un ácido nucleico diana monocatenario a una pluralidad de sondas de ácido nucleico. En una realización preferida, la pluralidad de sondas comprende sondas que son complementarias a diferentes posiciones de la diana de modo que la hibridación de los miembros de la pluralidad con una diana de tipo silvestre produce una serie continua de sondas a lo largo de al menos una parte de la secuencia diana cuando la diana es una diana de tipo silvestre. Pueden emplearse sondas que incluyen ARN, ADN y/o ácido péptido-nucleico (PNA) para hibridar con el ácido nucleico diana. No es necesario ligar la serie de sondas para formar una cadena continua, aunque puede realizarse ligamiento a juicio del usuario.

Cuando la diana es una secuencia de tipo silvestre, no habrá una parte monocatenaria en la región en la que se adosan las sondas. Sin embargo, cuando existe una mutación u otra alteración en la región de la diana a la que están dirigidas las sondas, una o más de las sondas no lograrán hibridar, produciendo una o más partes monocatenarias de la región diana. La identificación de esta región monocatenaria es, de acuerdo con la invención, un ensayo positivo para una mutación

u otra alteración en la diana.

En una realización preferida, una región monocatenaria indicativa de una mutación en la diana se detecta exponiendo la diana, después de la hibridación de la sonda, a un agente que escinde selectivamente el ácido nucleico monocatenario. En una diana mutada, los métodos de la invención producen más de un dúplex "adosado" en la región diana. Se producen múltiples dúplex adosados bicatenarios por la escisión de la diana en la región monocatenaria en la que ninguna sonda logró hibridar. Se conocen numerosas enzimas de escisión que escinde selectivamente o degradan ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, nucleasa S1, MutY, MutS y del fríjol mungo). La identificación de un único dúplex contiguo que comprende la diana y las sondas adosadas contiguas tras la exposición al agente de escisión o degradación selectivo es indicativa de una región diana de tipo silvestre (no mutada). Como alternativa, los productos de escisión se miden para determinar, por ejemplo, si el peso molecular de los productos es diferente de que se esperaría de un único dúplex contiguo.

De acuerdo con la invención, pueden generarse ácidos nucleicos monocatenarios para formar la diana por métodos convencionales conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen desnaturalizar ácidos nucleicos bicatenarios y/o generar ácidos nucleicos monocatenarios en una reacción catalizada por enzima invitro donde se genera un exceso de una cadena. Los métodos preferidos incluyen capturar un ácido nucleico diana monocatenario en un soporte sólido o semisólido.

También en una realización preferida, el ensayo descrito anteriormente se combina para examinar múltiples dianas simultáneamente. Por tanto, se pueden buscar productos de escisión bicatenarios específicos para identificar la o las dianas mutadas específicas o simplemente se pueden identificar múltiples productos de escisión (resultantes, como se ha descrito anteriormente, de la interposición de regiones monocatenarias en la "diana adosada") como evidencia de una mutación en una de las dianas examinadas. Por ejemplo, se examinan múltiples dianas, conteniendo cada una un llamado "punto caliente" para mutación en cáncer, siendo la producción de una región diana monocatenaria después del adosado suficiente para producir una exploración positiva para cáncer o pre-cáncer.

Además, en otra realización preferida más, se diluye una muestra heterogénea añadiendo tampón, por ejemplo, tampón de muestra o ensayo, y la muestra diluida después se separa en fracciones. Las fracciones preferidas contienen un promedio de 1-5 moléculas de ácido nucleico de la muestra heterogénea original. Las fracciones separadas de muestra preferiblemente se amplifican por, por ejemplo, PCR, que concentra cada fracción de muestra separada de ácido nucleico diana....

1. Un método para detectar una alteración en un ácido nucleico diana que se sospecha que está en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de:

a) añadir, a una muestra biológica que se sospecha que contiene un ácido nucleico diana, una pluralidad de ácidos péptido-nucleicos monocatenarios que hibridan de forma contigua con una región de dicho ácido nucleico diana si dicha región está inalterada; b) añadir a dicha muestra biológica una agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios; y, c) detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana como la presencia de un producto de degradación de las etapas a) y b) resultante de la degradación dentro de dicha región de dicho ácido nucleico diana.

2. El método de la reivindicación 1, en el que al menos un miembro de dicha pluralidad de ácidos péptido-nucleicos monocatenarios comprende un extremo con un donante y un extremo con un inactivador.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las etapas de:

a) diluir una muestra biológica; y, b) separar dicha muestra biológica en fracciones de muestra separadas.

4. Un método para detectar una alteración en un ácido nucleico diana que se sospecha que está en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de:

a) añadir, a una muestra biológica que se sospecha que contiene un ácido nucleico diana, una pluralidad de sondas que hibridan con una región de dicho ácido nucleico diana de modo que un hueco separa una o más de las sondas hibridadas adyacentes, si dicha región está inalterada; b) añadir a dicha muestra biológica un agente en condiciones que degradan ácidos nucleicos monocatenarios más grandes que dicho tamaño de hueco; y c) detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana como la presencia de un producto de degradación de las etapas a) y b) resultante de las degradación dentro de dicha región monocatenaria de dicho ácido nucleico diana.

5. Un método para detectar una alteración en un ácido nucleico diana polimórfico que se sospecha que está en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de:

a) añadir, a una muestra biológica que se sospecha que contiene un ácido nucleico diana polimórfico, una pluralidad de sondas, comprendiendo dicha pluralidad sondas complementarias a cada variante polimórfica de dicho ácido nucleico diana, de modo que dichas sondas hibriden de forma contigua con una región de dicho ácido nucleico diana si dicha región está inalterada; b) añadir a dicha muestra biológica un agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios; y, c) detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana como la presencia de un producto de degradación de las etapas a) y b) resultante de la degradación dentro de dicha región de dicho ácido nucleico diana.

6. Un método para detectar una alteración en un ácido nucleico diana que se sospecha que está en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de:

a) añadir, a una muestra biológica que se sospecha que contiene un ácido nucleico diana, una pluralidad de ácidos nucleicos monocatenarios que hibridan de forma contigua con una región de dicho ácido nucleico diana si dicha región está inalterada; b) añadir a dicha muestra biológica un agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios; y, c) detectar una alteración en dicho ácido nucleico diana como la presencia de un producto de degradación de las etapas a) y b) resultante de la degradación dentro de dicha región de dicho ácido nucleico diana.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha alteración es una mutación asociada a enfermedad; y opcionalmente: (a) dicha enfermedad es cáncer; o (b) dicho método comprende adicionalmente la etapa de determinar la identidad de dicha alteración en dicho ácido nucleico diana.

8. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 6, en el que: (a) al menos un miembro de dicha pluralidad de ácidos nucleicos monocatenarios comprende un marcador detectable; o (b) dicho ácido nucleico diana que se sospecha que está en dicha muestra biológica comprende un marcador detectable; y en cualquier caso (a) o

(b) opcionalmente dicho marcador detectable se selecciona entre el grupo compuesto por una marca fluorescente, un isótopo radiactivo, y un marcador de peso molecular.

9. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 6 en el que: (a) cada miembro de dicha pluralidad de ácidos nucleicos monocatenarios es entre aproximadamente 8 y 30 nucleótidos de longitud; (b) cada miembro de dicha pluralidad de ácidos nucleicos

monocatenarios tiene una temperatura de fusión de hibridación aproximadamente equivalente con dicho ácido nucleico diana; (c) dicho ácido nucleico diana se une a un soporte sólido; y opcionalmente el extremo 5' de dicho ácido nucleico diana se une a dicho soporte sólido, o el extremo 3' de dicho ácido nucleico diana se une a dicho 5 soporte sólido; (d) dicha muestra biológica comprende un tejido o fluido corporal; (e) dicho agente es una enzima, y opcionalmente dicha enzima se selecciona entre el grupo compuesto por nucleasa S1, MutY, MutS y de fríjol mungo; (f) dicho agente es un agente químico; (g) dicha alteración es una mutación asociada a enfermedad y se selecciona entre el grupo compuesto por inserciones, deleciones, reordenamientos, 10 transiciones, traslaciones, transversiones, y sustituciones de nucleótidos; (h) dicha muestra biológica comprende un tejido o fluido corporal seleccionado entre el grupo compuesto por esputo, fluido pancreático, bilis, linfa, plasma, orina, fluido cefalorraquídeo, fluido seminal, saliva, aspirado del pezón de la mama, pus, tejido de biopsia, células fetales, y fluido amniótico; (i) dicha muestra biológica es una muestra de deposiciones; (j) dicha alteración es un polimorfismo de un único nucleótido; (k) dicha alteración es heredada; o (1) dicha alteración existe como una subpoblación en una muestra heterogénea.

10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente que degrada ácidos nucleicos monocatenarios escinde selectivamente ácido nucleico monocatenario.