PROCEDIMIENTO PARA EL ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS AMPLIFICADOS.
Procedimiento para el análisis de ácidos nucleicos en un dispositivo microfluídico,
cuyo procedimiento presenta las etapas siguientes: a) la amplificación de los ácidos nucleicos en una primera cámara en el dispositivo microfluídico; b) la puesta en contacto de los ácidos nucleicos amplificados con un aditivo, adecuado para llevar a cabo la elaboración de los ácidos nucleicos amplificados, destinados a una hibridación subsiguiente sobre oligonucleótidos sonda, cuyo aditivo presenta: i.) cationes monovalentes y ii.) un agente enlazante de los iones Mg 2+ , estando previsto el aditivo, que está acumulado en forma de reactivo seco, en una segunda cámara en el dispositivo microfluídico y; c) la hibridación de los ácidos nucleicos amplificados sobre, al menos, un oligonucleótido sonda, siendo empleada para llevar a cabo la reacción de hibridación una mezcla constituida por el producto de la amplificación en bruto y por el aditivo
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/055335.
Solicitante: SIEMENS AKTIENGESELLSCHAFT.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: WITTELSBACHERPLATZ 2 80333 MUNCHEN ALEMANIA.
Inventor/es: GUMBRECHT, WALTER, DR., STANZEL,MANFRED,DR, PAULICKA,Peter.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 31 de Mayo de 2007.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68B6
- C12Q1/68D2
Clasificación PCT:
- B01L3/00 TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES. › B01 PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL. › B01L APARATOS DE LABORATORIO PARA LA QUIMICA O LA FISICA, DE USO GENERAL (aparatos de uso médico o farmacéutico A61; aparatos para aplicaciones industriales o aparatos de laboratorio cuya estructura y funciones son comparables a las de aparatos industriales similares, ver las clases relativas a los aparatos industriales, en particular las subclases B01 y C12; aparatos de separación o de destilación B01D; dispositivos de mezcla o de agitación B01F; atomizadores B05B; tamices, cribas B07B; tapones, capuchones B65D; manipulación de líquidos en general B67; bombas de vacío F04; sifones F04F 10/00; grifos, válvulas F16K; tubos, empalmes para tubos F16L; aparatos especialmente adaptados al estudio y análisis de materiales G01, particularmente G01N; aparatos eléctricos u ópticos, ver las subclases apropiadas en las secciones G y H). › Recipientes o utensilios para laboratorios, p. ej. cristalería de laboratorio (botellas B65D; equipos para enzimología o microbiología C12M 1/00 ); Cuentagotas (recipientes para volumetría G01F).
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
PDF original: ES-2359172_T3.pdf
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Fragmento de la descripción:
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La invención se refiere a un procedimiento para llevar a cabo el análisis de ácidos nucleicos amplificados en un dispositivo microfluídico. De igual modo, la invención se refiere a una agrupación para llevar a cabo la realización de un procedimiento de este tipo.
Estado de la técnica.
El análisis de ADN por medio de la hibridación constituye un procedimiento conocido en la biología molecular (véase la publicación "Gentechnische Methoden", G.Gassen y G.Schrimpf, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1999, paginas 243 hasta 261). Esta técnica juega un papel importante para llevar a cabo la detección de ácidos nucleicos específicos, por ejemplo en el diagnóstico molecular de mutaciones puntuales individuales (single nucleotide polymorphism, SNP). En este caso, es empleado un oligonucleótido sonda, que está constituido por una secuencia de, por ejemplo, aproximadamente 20 nucleótidos, con objeto de enlazar a los ácidos nucleicos, que se diferencian únicamente en un solo nucleótido. Debe indicarse que, en el presente contexto, el concepto de “ácidos nucleicos” debe abarcar una secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo una secuencia de ADN o una secuencia de ARN. Cuando se lleva a cabo una elección adecuada de las condiciones para la hibridación (especialmente la temperatura y la concentración salina), el oligonucleótido sonda enlaza de forma selectiva a las variantes no mutadas del ácido nucleico, mientras que las variantes del ácido nucleico, que presentan mutación puntual individual, no son enlazadas o únicamente son enlazadas débilmente. De este modo, es posible una detección de las mutaciones puntuales individuales. Como consecuencia de las pequeña diferencia entre la energía de enlace de la variante sin mutación (es decir del tipo natural) y del mutante, las condiciones de la reacción deben cumplir parámetros exactos en lo que se refiere a la temperatura así como a la composición y a la concentración salina de la solución de la reacción.
Puesto que los correspondientes ácidos nucleicos en el material de muestra (por ejemplo la sangre) no están disponibles en la mayoría de las ocasiones en cantidades o bien en concentraciones suficientes, es necesario llevar a cabo una amplificación de los ácidos nucleicos, que deben ser analizados. Esta amplificación puede ser llevada a cabo, de manera específica para la secuencia, por medio de diversos procedimientos, que son conocidos en la biología molecular, por ejemplo por medio de la amplificación por desplazamiento patrón ADS (strand displacement amplification), que ha sido descrito en la publicación de los autores Walker, GT, et al., "Strand Displacement Amplification, an isothermal, invitro DNA Amplification Technique", Nucleic Acids Research, 1992, 20, 1961 hasta 96; con ayuda de la amplificación por medio de transcripción TMA (transcription mediated amplification), que ha sido descrita en www.gen-probe.com/sci_tec/tea.htm; o por medio de la reacción en cadena de polimerasa (polymerase chain reaction, RCP), que está descrita, entre otras, en la patente norteamericana US 4 683 195. En este caso constituye un problema el que la composición de la solución de la reacción para la reacción de amplificación y, por lo tanto, el “producto de la amplificación en bruto”, no presenta la composición y, de manera especial, no presenta la concentración salina, que son necesarias para llevar a cabo la hibridación. Por otra parte, con objeto de llevar a cabo un diagnóstico molecular, puede ser necesario efectuar una separación selectiva de los híbridos formados en un proceso subsiguiente (fusión), por ejemplo por medio de un aumento de la temperatura. Con objeto de posibilitar los procesos de hibridación con elevado rendimiento se requiere, entre otras cosas, una elevada concentración en cationes monovalentes (por ejemplo iones Na+). Los cationes monovalentes favorecen el enlace de la estructura de doble hélice con ocasión de la reacción de hibridación.
Sin embargo, las cargas de reacción para llevar a cabo las reacciones de amplificación, por ejemplo una reacción RCP, contienen una baja concentración en cationes monovalentes. Por otra parte, los tampones para la reacción RCP presenta una concentración relativamente elevada (algunos mM) en iones Mg2+, que tienen un efecto negativo con ocasión de la hibridación en sondas de detección sobre el enlace de las sondas y de las hebras complementarias, para formar los híbridos completos, pueden provocar una prolongación de las sondas como consecuencia de la actividad polimerasa y pueden provocar una estabilización de las hebras dobles con ocasión de un proceso de fusión subsiguiente, y pueden dificultar la fusión, lo cual conduce a curvas de fusión “difusas” a elevadas temperaturas.
De conformidad con el estado de la técnica, los productos de la amplificación son purificados, por este motivo, como paso previo a la reacción de hibridación, siendo eliminados en este caso todos los componentes perjudiciales para una reacción de hibridación (entre otros la polimerasa, los cebadores, los nucleótidos, las sales) y siendo aumentada la concentración en iones Na+. Este proceso de purificación es relativamente complicado y se lleva a cabo, de manera usual, por medio de un enlace inespecífico de los ácidos nucleicos sobre una fase sólida (por medio de las denominadas columnas de purificación), lavado del producto de la amplificación en la columna y disolución de la fase sólida o por medio de una extracción con fenol/cloroformo o según procedimientos similares. De manera especial, con ocasión de la realización de los análisis de los ácidos nucleicos en dispositivos microfluídicos, en los
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que se desarrollan todos los procesos de reacción de forma integrada y en un pequeño recinto, no entran en consideración los procedimientos de purificación, que son usuales en el estado de la técnica, puesto que su realización es muy complicada bajo estas circunstancias.
Los autores Liu et al (Anal. Chem. 2004, 76, 1824-1831) divulgan un procedimiento para llevar a cabo el análisis de los ácidos nucleicos en un dispositivo microfluidico, que comprende las etapas de llevar a cabo la amplificación de los ácidos nucleicos en una primera cámara del dispositivo microfluídico, la puesta en contacto de los ácidos nucleicos amplificados con un tampón de la hibridación en una segunda cámara en el dispositivo microfluídico y la hibridación de los ácidos nucleicos amplificados en, al menos, un oligonucleótido sonda.
Planteamiento de la tarea.
La tarea de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento sencillo y económico, que posibilite la elaboración eficiente de ácidos nucleicos amplificados para otras etapas del procedimiento, cuyo procedimiento no exija etapas adicionales de enlace o de lavado y que pueda ser realizado con un sencillo concepto de fluídica.
Descripción de la invención.
Expresado de una manera general, la idea inventiva consiste en llevar a cabo la amplificación de una muestra con ácidos nucleicos y en combinar la muestra, que contiene el producto de la amplificación en bruto, con un aditivo adecuado, con objeto de llevar a cabo la elaboración del producto de la amplificación en bruto para otras etapas del procedimiento, por ejemplo para otras etapas de análisis. Por medio del aporte del aditivo se evita la necesidad de tener que purificar los ácidos nucleicos amplificados. Este procedimiento es especialmente adecuado para ser empleado en dispositivos microfluídicos, en los cuales son preferentes desarrollo de procedimientos no complicados con un sencillo concepto de fluídica. De conformidad con la invención, el aditivo presenta cationes monovalentes y un agente enlazante de los iones Mg2+. Un aditivo de ese tipo es especialmente adecuado para llevar a cabo la elaboración de ácidos nucleicos amplificados destinados a una hibridación subsiguiente sobre oligonucleótidos sonda.
De conformidad con la invención, se resuelve la tarea, de manera especial, por medio del procedimiento de conformidad con la reivindicación 1. En las reivindicaciones de procedimiento dependientes están indicados desarrollos ventajosos. Un sistema correspondiente, para llevar a cabo la realización del procedimiento, de conformidad con la invención, constituye el objeto de la reivindicación 16. Desarrollos de este sistema están indicados en las reivindicaciones materiales dependientes.
De conformidad con la presente invención se proporciona,... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para el análisis de ácidos nucleicos en un dispositivo microfluídico, cuyo procedimiento presenta las etapas siguientes:
a) la amplificación de los ácidos nucleicos en una primera cámara en el dispositivo microfluídico;
b) la puesta en contacto de los ácidos nucleicos amplificados con un aditivo, adecuado para llevar a cabo la elaboración de los ácidos nucleicos amplificados, destinados a una hibridación subsiguiente sobre oligonucleótidos sonda, cuyo aditivo presenta:
i.) cationes monovalentes y
ii.) un agente enlazante de los iones Mg2+ ,
estando previsto el aditivo, que está acumulado en forma de reactivo seco, en una segunda cámara en el dispositivo microfluídico y;
c) la hibridación de los ácidos nucleicos amplificados sobre, al menos, un oligonucleótido sonda, siendo empleada para llevar a cabo la reacción de hibridación una mezcla constituida por el producto de la amplificación en bruto y por el aditivo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los cationes monovalentes están previstos en forma de iones Na+.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el agente enlazante de los iones Mg2+ es el EDTA.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se introduce un disolvente en la segunda cámara como paso previo a la puesta en contacto del aditivo con el ácido nucleico amplificado.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que es transferido el aditivo, en forma disuelta, desde la segunda cámara hasta la primera cámara, con objeto de poner en contacto al aditivo con los ácidos nucleicos amplificados.
6. Procedimiento según una de las reivindicación 1 a 3, en el que los ácidos nucleicos amplificados son transferidos desde la primera cámara hasta la segunda cámara, con objeto de poner en contacto al aditivo con los ácidos nucleicos amplificados.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que los ácidos nucleicos amplificados son transferidos en solución, en forma de producto de la amplificación en bruto, hasta la segunda cámara y, a continuación, son conducidos en forma de mezcla con el aditivo con el oligonucleótido sonda, al menos único.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la amplificación de los ácidos nucleicos se lleva a cabo por medio de una reacción RCP.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el oligonucleótido sonda, al menos único, está inmovilizado en forma de un sistema, en forma de micromatriz, sobre un soporte.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se lleva a cabo una detección de los ácidos nucleicos hibridizados, amplificados sobre los oligonucleótidos sonda.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la detección se lleva a cabo con aprovechamiento de una etiqueta (un marcador) de los ácidos nucleicos amplificados.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la etiqueta es una etiqueta óptica o es una etiqueta enzimática.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la etiqueta cataliza una reacción enzimática, que puede ser detectada de forma óptica o electroquímica.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la detección electroquímica está constituida por una medición de la corriente eléctrica intensificada por medio de una fluctuación redox.
15. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el aditivo presenta un agente aglutinante.
16. Sistema para llevar a cabo la realización del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, que está previsto en un dispositivo microfluídico, que presenta:
5 a) una primera cámara, que está proyectada para llevar a cabo la amplificación de los ácidos nucleicos, y
b) una segunda cámara, en la que está acumulado un aditivo estable al almacenamiento en forma de reactivo seco, que es adecuado para llevar a cabo la elaboración de ácidos nucleicos amplificados destinados a una hibridación subsiguiente sobre oligonucleótidos sonda, cuyo aditivo presenta
i) cationes monovalentes y
10 ii) un agente enlazante de los iones Mg2+ ,
pudiendo ser conectada en comunicación fluídica la segunda cámara, a través de una conexión, con la primera cámara, pudiendo ser puestos en contacto los ácidos nucleicos amplificados con el aditivo de tal manera, que se encuentre a disposición una mezcla constituida por el producto de la amplificación en bruto y por el aditivo, para llevar a cabo una reacción de hibridación.
17. Sistema según la reivindicación 16, en el que los cationes monovalentes están previstos en forma de iones Na+.
18. Sistema según una de las reivindicaciones 16 ó 17, en el que el agente enlazante de los iones Mg2+ es el EDTA.
19. Sistema según una de las reivindicaciones 16 a 18, en el que están previstos medios para llevar a cabo la transferencia del fluido selectivamente desde la primera cámara hasta la segunda cámara.
20. Sistema según una de las reivindicaciones 16 a 18, en el que están previstos medios para llevar a cabo la 20 transferencia del fluido selectivamente desde la segunda cámara hasta la primera cámara.
21. Sistema según la reivindicación 20, en el que están previstos medios para introducir un disolvente en la segunda cámara.
22. Sistema según una de las reivindicaciones 16 a 21, que presenta, además, un sistema en forma de micromatriz, que presenta oligonucleótidos sonda, que están inmovilizados sobre un soporte.
25 23 Sistema según una de las reivindicaciones 6 a 22, que presenta, además, medios para llevar a cabo la detección óptica o electroquímica de ácidos nucleicos hibridizados.
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