El uso de una citocina que es capaz de inducir la expresión del CD73 endotelial,

en que dicha citocina es el interferón beta, en combinación con una cantidad eficaz de monofosfato de adenosina, para la fabricación de una composición farmacéutica útil para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno, que es un trauma tisular; una lesión por reperfusión que resulta de un infarto de miocardio o un accidente cerebrovascular, trasplantes de órganos u otra operación quirúrgica; cáncer o metástasis cancerosa, o un estado inflamatorio

Elevación del nivel de adenosina mediante la expresión inducida por citocina de CD73.

Campo del invento

Este invento se refiere a métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedades o trastornos que se benefician de un elevado nivel de adenosina, como se define en la Reivindicación 1.

Fundamento del invento

La interacción entre linfocitos y células endoteliales es un proceso de múltiples etapas. Para poder penetrar en la pared vascular y alcanzar el sitio diana, las células circulantes usan un conjunto muy finamente regulado de moléculas de adhesión. Una adhesión potenciada al endotelio y la subsiguiente transmigración de leucocitos recirculantes al tejido a través del revestimiento endotelial de la pared vascular son características de la inflamación. Además, en los sitios de inflamación tiene lugar la liberación de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias en un grado elevado. Esas citocinas son potentes reguladores de la expresión de moléculas de adhesión.

CD73 (ecto-5'-nucleotidasa) es una molécula de 70 kDa de la superficie celular, anclada a glicosil-fosfatidil-inositol, con actividad ectoenzimática. Se expresa abundantemente en el endotelio vascular y con bajo nivel en ciertas subpoblaciones de linfocitos humanos. Es parte de la ruta de recuperación de purinas al degradar nucleósido-5'-monofosfatos (AMP e IMP) hasta nucleósidos como adenosina e inosina (1).

La adenosina, un producto nucleosídico de purina de la actividad enzimática de CD73, se une a receptores específicos de la superficie celular. Se ha comunicado que la adenosina desempeña un papel en muchos procesos fisiológicos y patológicos. Hasta ahora, se han clonado cuatro subtipos diferentes de receptores de adenosina acoplados a proteína G, A1R, A2aR, A2bR y A3R. A causa de la diversidad de receptores y de su abundante localización en diferentes tejidos, la interacción adenosina-receptor de adenosina conduce a diversas respuestas fisiológicas. La adenosina, al unirse a los receptores A1 y A2, regula consecuencias patológicas de la inflamación al controlar la unión de leucocitos al endotelio y, al unirse a los receptores A2 y A3, actúa como un agente antiinflamatorio a través de la inhibición de la desgranulación de los neutrófilos (2). La adenosina también disminuye la migración de eosinófilos por medio de la activación del receptor A3. Este efecto activador del 5'-AMP está mediado por CD73 y va seguido de un aumento del cAMP intracelular. Recientemente, se ha mostrado un papel crítico del receptor A2a en la disminución de respuestas inflamatorias sistémicas y tisularmente específicas in vivo.

La adenosina previene el daño celular durante las isquemias cardiaca y nerviosa central (3-5). La actividad ecto-5'-nucleotidasa aumenta después de una hipoxia debido a un fenómeno conocido como preacondicionamiento. Esto da lugar a la liberación de grandes cantidades de adenosina, lo que conduce a una resistencia aumentada de las células al infarto en, por ejemplo, una hipoxia cardiaca.

Hasta ahora, no se sabe casi nada acerca de la regulación de la expresión y la función del CD73 endotelial. Sin embargo, en la inflamación, puede haber ciertos agentes inductores secretados que controlen específicamente in vivo la expresión del CD73 endotelial.

Puesto que la adenosina, que tiene un efecto antiinflamatorio y celularmente protector, desempeña un papel importante en el control de la extensión y las consecuencias de la inflamación, se diseñó este trabajo para identificar factores responsables de la regulación de la expresión de CD73 así como de la producción de adenosina mediada por ecto-5'-nucleotidasa.

Como tal, la adenosina podría ser administrada a pacientes aquejados de estados inflamatorios o estados que, en caso de no ser tratados, probablemente desembocarían en una inflamación tisular. Sin embargo, un inconveniente importante de la administración directa de adenosina es la rápida eliminación de la adenosina in vivo. Por lo tanto, este trabajo presenta un nuevo modo de conseguir niveles elevados de adenosina durante un tiempo prolongado.

Objetos y sumario del invento

El objeto principal del presente invento es proporcionar un método para aumentar el nivel de adenosina en un individuo y para mantener el nivel elevado de adenosina durante un periodo prolongado de tiempo y, de este modo, prevenir o tratar estados inflamatorios o estados que, en caso de no ser tratados, desembocarían en una inflamación tisular.

Por consiguiente, este invento se refiere al uso de una citocina que es capaz de inducir la expresión de CD73 endotelial, en que dicha citocina es el interferón beta, en combinación con una cantidad eficaz de monofosfato de adenosina, para la fabricación de una composición farmacéutica útil para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno, que es un trauma tisular; una lesión por reperfusión que resulta de un infarto de miocardio o un accidente cerebrovascular, trasplantes de órganos u otra operación quirúrgica; cáncer o metástasis cancerosa, o un estado inflamatorio.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una presentación gráfica que muestra que la inducción de la expresión superficial de CD73 en HUVEC por IFN-a depende tanto del tiempo como de la dosis. En el Gráfico (a), se expusieron HUVEC a 1000 U/ml de IFN-a durante los periodos de tiempo indicados. En el Gráfico (b), se cultivaron HUVEC con IFN-a en diferentes concentraciones durante 72 horas. Se muestran las medias relativas de la intensidad media de fluorescencia (MFI; del inglés, mean fluorescence intensity) pm el error estándar de la media (SEM; del inglés, standard error of mean) de 3-9 experimentos. La expresión testigo es la expresión de CD73 sin IFN-a en cada punto temporal. Se resta el fondo (tinción testigo negativo). *P < 0,05; **P < 0,01.

La Figura 2 es una fotografía microscópica que demuestra que la inducción de CD73 con IFN-alfa conduce a una expresión aumentada en lugar de a cambios en su distribución. Se cultivaron HUVEC en medio o se sometieron a inducción con IFN-alfa durante 72 horas, y se detectó la expresión de CD73 en la superficie celular con el anticuerpo monoclonal (mAb; del inglés, monoclonal antibody) 4G4 contra CD73 y un anticuerpo anti-IgG de ratón, conjugado con FITC. (a) En HUVEC testigo, el CD73 se expresa en la superficie celular siguiendo un patrón en forma de puntos. (b) Después de la inducción con IFN-a, el CD73 aparece más intenso pero su distribución superficial es similar a la de las HUVEC testigo. Tinción con un anticuerpo testigo negativo, 3G6, sobre HUVEC testigo (c) y después de la inducción con IFN-a (d). Ampliación original: 400x; escala gráfica: 10 µm.

La Figura 3 es una presentación gráfica de la expresión relativa de mRNA de CD73 en HUVEC. Se incubaron HUVEC con y sin IFN-alfa durante 72 horas. Se llevaron a cabo análisis por RT-PCR en tiempo real con TaqMan. La figura representa la expresión relativa de mRNA de CD73 entre células testigo y células tratadas con IFN-alfa. Se llevó a cabo una normalización utilizando el gen doméstico GAPDH. Los datos presentan los valores medios de tres experimentos realizados por duplicado pm SEM, *P < 0,05.

La Figura 4 es un gráfico que muestra que la regulación de la expresión del CD73 linfoide difiere de la de las células endoteliales. Se cultivaron células U266B1 y PBL en el medio con y sin 100 U/ml de IFN-a durante diferentes períodos. No se ven cambios significativos en los PBL (barras blancas) ni las U266B1 (barras negras) cuando se exponen a IFN-a durante los períodos indicados de tiempo, en comparación con las células testigo no tratadas. Se muestran los valores medios relativos de MFI pm SEM de 3-6 experimentos/punto temporal.

La Figura 5 es un resumen del análisis semicuantitativo de tinciones inmunohistoquímicas de muestras de vejiga urinaria procedentes de áreas sanas (Gráfico a) y tumorales (Gráfico b), antes y después del tratamiento con IFN.

En la Figura 6 se muestran fotografías microscópicas que demuestran el efecto de IFN-a sobre la expresión de CD73 en carcinoma de vejiga. (a) Una muestra de cáncer de vejiga teñida con un mAb anti-CD73, 4G4, antes del tratamiento con IFN-a. Algunos vasos expresan CD73 ligera o moderadamente. (b) El mismo tumor teñido con el mAb anti-CD73, 4G4, después del tratamiento con IFN-alfa. Los vasos expresan CD73 moderada o abundantemente. (c) Tinción con un anticuerpo...

1. El uso de una citocina que es capaz de inducir la expresión del CD73 endotelial, en que dicha citocina es el interferón beta, en combinación con una cantidad eficaz de monofosfato de adenosina, para la fabricación de una composición farmacéutica útil para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno, que es un trauma tisular; una lesión por reperfusión que resulta de un infarto de miocardio o un accidente cerebrovascular, trasplantes de órganos u otra operación quirúrgica; cáncer o metástasis cancerosa, o un estado inflamatorio.

2. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la enfermedad o trastorno es un trauma tisular; una lesión por reperfusión que resulta de un infarto de miocardio o un accidente cerebrovascular, cáncer o metástasis cancerosa, o un estado inflamatorio, y en que la administración de la citocina se inicia tan pronto como el paciente comienza a ser atendido.

3. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en que la enfermedad es una lesión por reperfusión que resulta de trasplantes de órganos u otra operación quirúrgica, y la administración de la citocina se inicia antes de la operación quirúrgica.