CD73 como biomarcador para monitorizar el desarrollo de enfermedades y evaluar la eficacia de terapias.

Un método para evaluar la eficacia de una terapia con citoquina o una terapia con estatina en un paciente que padece una enfermedad,

en el que se usa como biomarcador la CD73 de un líquido tisular extraído de dicho paciente, en donde el método se repite en dos o más momentos diferentes y se compara un nivel alterado de CD73 de la muestra, con el de un análisis previo, y se usa para estimar la eficacia de la terapia.

CD73 como biomarcador para monitorizar el desarrollo de enfermedades y evaluar la eficacia de terapias Campo de la invención Esta invención se refiere al uso de CD73 en líquidos tisulares como un biomarcador para evaluar la eficacia de terapias. 5

Fundamento de la invención CD73 es una enzima de la superficie celular que tiene actividad de 5'-ectonucleotidasa. Por tanto media la conversión de nucleótidos de purina monofosforilados en los nucleósidos correspondientes. Por ejemplo, la desfosforilación de AMP a adenosina es catalizada por CD73. La CD73 está presente también en una forma soluble en el plasma y la enzima soluble tiene la misma actividad enzimática que la forma unida a membranas. 10

La adenosina es uno de los reguladores fisiológicos de la permeabilidad celular endotelial [1, 2], y por tanto puede estar implicada en la patogénesis de muchos trastornos como lesión pulmonar aguda, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, síndrome de dificultad respiratoria, la enfermedad mal de altura. En la inflamación, en traumatismos y en el cáncer también tienen lugar cambios en la permeabilidad endotelial. La CD73 controla la permeabilidad endotelial vía un mecanismo mediado por adenosina en condicionas normales, en hipoxia y en lesión 15 pulmonar inducida por un aparato respirador [3-7].

La CD73 es inducida por ciertas citoquinas. Del modo más importante se ha descrito que los interferones alfa y beta aumentan la expresión y la actividad de CD73 en seres humanos (8, WO 2004/084933, 11) . Estas citoquinas se usan también en clínica para tratar diferentes enfermedades. El interferón alfa, por ejemplo, se usa para tratar ciertas infecciones y enfermedades malignas, tales como hepatitis y leucemia de células pilosas. El interferón beta, por otro 20 lado, se usa ampliamente para disminuir la inflamación en la esclerosis múltiple. Sin embargo, en muchos casos la respuesta beneficiosa al tratamiento con interferón sólo se aprecia en una subpoblación de pacientes, y también los pacientes que responden inicialmente pueden más tarde ser refractarios al tratamiento. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar biomarcadores fácilmente medibles que reflejen la capacidad de respuesta biológica del cuerpo al tratamiento. 25

La solicitud de patente publicada WO 2004/084933 y el correspondiente documento US 2006/198821 describen el uso de citoquinas para inducir la expresión endotelial de CD73 y elevar subsiguientemente el nivel de adenosina en un individuo. Está descrito el uso de interferón beta en combinación con monofosfato de adenosina (AMP) en el tratamiento de insuficiencia multiorgánica en ratas.

La solicitud de patente publicada WO 2007/042602 describe el uso de interferón beta puro para el tratamiento o 30 prevención de la lesión por isquemia-reperfusión o insuficiencia multiorgánica.

Las publicaciones OPL 121, "IFN-beta-treatment augments adenosine production via CD73 (ecto-5'-nucleotidase) upregulation both on cultured endothelial cells in vitro and in multiple sclerosis patients in vivo", Journal of Neurological Sciences, Elsevier Scientific Publishing co. Amsterdam, vol. 328, 1 de enero de 1995 y Laura Airas et al., Ann.N.Y. Acad.Sci.1110:641-648 (2007) describen que administrar interferón beta a pacientes que padecen 35 esclerosis múltiple provoca un incremento de CD73. Sin embargo, no se sugería el uso de CD73 como marcador para monitorizar el desarrollo de una enfermedad.

El documento US 6.861.225 describe un método para determinar la actividad de 5'-nucleotidasa en una muestra biológica.

El documento WO 97/13875 describe métodos para determinar el resultado de la terapia con citoquina en pacientes 40 que padecen infecciones causadas por virus crónicas. También se describen kits para usar en estos métodos.

S. Ledooux et al. "Lovastatin enhances Ecto-5'-nucleotidase activity and cell surface expression in endothelal cells: Implication of Rho-Family GPTases", Circ.res. 2002;90:420-427, describe que la producción extracelular de adenosina por la Ecto-5'-nucleotidasa anclada mediante GPI desempeña un papel importante en el sistema cardiovascular para la defensa contra la hipoxia. 45

A Ostapkowicz et al., Mol Cancer Ther 2006; 5 (2) , Febrero de 2006, págs. 238-245 describe que durante la transición al cáncer de mama invasivo hay una reorganización estructural significativa de las balsas lipídicas y del citoesqueleto subyacente que se invierte tras la inhibición de la desacetilasa de histona.

Se sabe que las estatinas, agentes hipolipidémicos usados para disminuir el nivel de colesterol inducen la expresión de CD73 en los pacientes. 50

Sin embargo, en la técnica anterior no hay descripciones referentes a la medida de la proteína CD73 en suero o cualquier otro líquido tisular para uso como un biomarcador para monitorizar el desarrollo de enfermedades o para evaluar la eficacia de las terapias.

Sumario de la invención Los autores de la presente invención hemos demostrado que la actividad de la CD73 soluble se puede usar para monitorizar la gravedad y la capacidad de respuesta de una enfermedad a la terapia. Por lo tanto, creemos que el análisis del nivel de expresión o actividad de la CD73 por cualquier técnica puede proporcionar una valiosa 5 información del curso de una enfermedad o de la respuesta al tratamiento.

Así, esta invención concierne a un método para evaluar la eficacia de una terapia con citoquina o una terapia con estatina en un paciente que padece una enfermedad en la que, la proteína CD73 de un liquído tisular extraído de dicho paciente se usa como biomarcador, donde el método se repite en dos o más momentos diferentes y se usa un nivel de CD73 en la muestra alterado, respecto a un ensayo previo, para estimar la eficacia de la terapia. 10

Breve descripción de los dibujos Figura 1. La lesión por isquemia-reperfusión del intestino induce daño tisular primario y secundario. La arteria mesentérica fue ocluida durante 30 minutos y luego se permitió la reperfusión (restablecimiento del flujo sanguíneo) durante 4 horas. Las microfotografías representativas del (A) intestino y (B) pulmones de ratones de tipo natural (TN, es decir, no modificados genéticamente) después de la operación falsa (solamente laparotomía) y después de la 15 inducción de lesión por isquemia-reperfusión (IR) .

Figura 2. La actividad de CD73/5'NT sobre los pulmones se correlaciona inversamente con la actividad de la enfermedad. Ratones CD73/5â?NT-/- y sus compañeros de camada de tipo natural (TN) , fueron sometidos a una operación falsa o a 30 minutos de isquemia intestinal seguida por 240 minutos reperfusión (por LPA) . En otros grupos, los animales expuestos a LPA fueron tratados previamente con IFN-. (A) Actividad de CD73/5'NT sobre el 20 pulmón (valor medio ± error estándar, nmol de AMP hidrolizado por miligramo de proteína por hora) medida en lisados de tejidos por cromatografía en capa delgada (CCD) . (B) Análisis semicuantitativo de fuga vascular [ (exudación de dextrano conjugado con fluorescein-isotiocianato (FITC) ] en los pulmones medido en cortes histológicos usando análisis de imagen (% del área del corte que exhibe fluorescencia por encima de un valor de fondo elegido arbitrariamente, valores medios ± error estándar) . También se muestran microfotografías 25 representativas de los grupos indicados. Barra, 50 m. *p<0, 05. **p<0, 01.

Figura 3. Actividad de CD73/5'NT en pacientes con SRIS que padecen pancreatitis. La figura muestra la actividad de CD73/5'NT frente al grado de gravedad de la pancreatitis: 0 = pancreatitis suave; 1 = pancreatitis grave sin insuficiencia del órgano; 2 = pancreatitis grave con insuficiencia del órgano; 3 = control sano.

Figura 4. Actividad de CD73/5'NT frente a la estancia total en la unidad de tratamiento intensivo (UTI) para 30 pacientes con todos los grados de pancreatitis.

Descripción detallada de la invención

Definiciones y realizaciones preferidas:

El término "paciente" o "individuo" se refiere a un ser humano o a un sujeto animal.

El término "monitorizar el desarrollo de una enfermedad" significa que el agravamiento de la enfermedad (es decir, el 35 empeoramiento de la enfermedad) o la remisión de la enfermedad (es decir, la recuperación del paciente) pueden ser detectados comparando un nivel medido del biomarcador con un valor de control o una o más medidas previas, realizadas en diferentes momentos, del nivel del biomarcador en el mismo paciente. Por ejemplo, se puede usar un menor nivel del biomarcador, comparado con el resultado de una medida previa o con un valor de control para indicar el agravamiento de la enfermedad, mientras que se usa un mayor nivel del biomarcador,... [Seguir leyendo]

1. Un método para evaluar la eficacia de una terapia con citoquina o una terapia con estatina en un paciente que padece una enfermedad, en el que se usa como biomarcador la CD73 de un líquido tisular extraído de dicho paciente, en donde el método se repite en dos o más momentos diferentes y se compara un nivel alterado de CD73 de la muestra, con el de un análisis previo, y se usa para estimar la eficacia de la terapia. 5

2. El método según la reivindicación 1, en el que la terapia con citoquina se usa para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en:

a) traumatismo tisular b) una lesión por reperfusión como resultado de infarto de miocardio o ictus, trasplante de órganos u otra operación quirúrgica, 10

c) cáncer o metástasis de cáncer, y d) un estado inflamatorio.

3. El método según la reivindicación 1, en donde la terapia con estatina se usa para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad cardiovascular, un estado inflamatorio, demencia, cáncer, catarata nuclear e hipertensión pulmonar. 15