BIOTINA-SOPORTE POROSO, METODOS DE OBTENCION Y USOS.

Compuesto que comprende biotina unida a un soporte poroso mediante un "linker" (grupo de unión o enlazante) que contiene el grupo 1,

2,3- triazol. La invención también se refiere al método de obtención del compuesto y a sus usos para la purificación de avidina y proteínas biotiniladas, así como para el marcaje fluorescente de avidina

Biotina-soporte poroso, métodos de obtención y usos.

La presente invención se refiere a un compuesto que comprende biotina unida a un soporte poroso inorgánico mediante un "linker" (grupo de unión) que contiene el grupo 1,2,3-triazol. Más particularmente, el soporte poroso inorgánico es sílice. Además, se refiere a su método de obtención y sus usos para la purificación de avidina y proteínas biotiniladas, así como para el marcaje fluorescente de avidina.

Estado de la técnica anterior

La biotina es una vitamina esencial en el metabolismo que constituye el grupo prostético de un conjunto de enzimas denominado carboxilasas que participan en reacciones clave del metabolismo intermediario. El déficit de biotina, o defectos genéticos que impiden su unión covalente a las carboxilasas, conduce a graves enfermedades metabólicas, que normalmente producen situaciones de acidosis y coma.

Una posible situación de deficiencia de biotina se produce por una ingesta excesiva de huevos crudos. En la clara de huevo existe una proteína denominada avidina (Cf. DeLange, R.J., 1969, J. Biol. Chem., vol. 245, pp. 907-916), que presenta la capacidad de unir fuertemente biotina y secuestrarla. De hecho, la constante de unión entre la biotina y la avidina es de aproximadamente 10^-15 M, lo que constituye probablemente la mayor afinidad por un ligando descrita para cualquier sistema biológico.

Esta alta afinidad, así como la relativa facilidad de obtener avidina, ha determinado que exista un alto interés en el estudio y desarrollo de sistemas de afinidad que se basen en la fuerte interacción entre estas dos moléculas. Así se han desarrollado sistemas de marcaje de proteínas, ácidos nucleicos, diversos constituyentes celulares e incluso células completas, para posteriormente ser reconocidos por moléculas de avidina, bien inmovilizada (creando sistemas de cromatografía de afinidad) o bien marcada por la unión a fluoróforos o enzimas (creando sistemas de detección, usualmente en fase sólida).

Las técnicas descritas en el párrafo anterior han sido utilizadas clásicamente en inmunología para la detección de antígenos o anticuerpos previamente biotinilados. Actualmente, esta tecnología está en un proceso de expansión, extendiéndose su uso a la proteómica y genómica, en el marcaje, separación y/o inmovilización de proteínas o ácidos nucleicos.

La interacción de la avidina con la biotina ocurre en condiciones fisiológicas de pH y fuerza iónica. Existen numerosos reactivos para la biotinilización de proteínas y existe comercialmente avidina (o una proteína análoga suya de origen bacteriano, la estreptavidina) ya sea sola, marcada con diferentes fluoróforos o inmovilizada sobre agarosa.

Un problema importante, y sólo parcialmente resuelto, de esta tecnología es, paradójicamente, la elevada afinidad de la avidina por la biotina. Esta elevada afinidad hace que sea necesario utilizar condiciones extremas para romper la interacción de ambas moléculas. Estas condiciones extremas implican usualmente el empleo de agentes desnaturalizantes como SDS o clorhidrato de guanidinio junto con pHs inferiores a 2.

En técnicas cromatográficas basadas en la interacción de la avidina con la biotina, ya sea para la purificación de la propia avidina o para la cromatografía de afinidad de moléculas marcadas con biotina, el uso de estas condiciones extremas de elución y la consiguiente desnaturalización de las proteínas dificulta las aplicaciones posteriores de las mismas.

Para soslayar este problema, se ha propuesto el uso de iminobiotina, con una menor afinidad por la avidina, como ligando. No obstante, el uso de iminobiotina es mucho más caro que el de biotina en el marcaje de ligandos y además no puede ser aplicado a las proteínas biotiniladas de manera natural. Otra alternativa ha sido el uso de columnas de afinidad que emplean avidina monomérica.

La purificación inicial de avidina por cromatografía de afinidad se realizó en 1968 (Cf. Cuatrecasas, P. et al., 1968, Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 33, pp. 235-239) utilizando una columna de biocitina-sefarosa. La elusión de la avidina de esta columna implicaba el uso de cloruro de guanidinio 6 M a pH 1.5. Posteriormente, en 1980 (Cf. Hofmann et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 77, pp. 4666-4668), fue descrito el uso de columna de iminobiotina para la purificación de estreptavidina utilizando condiciones de elución más suaves. La unión de avidina o estreptavidina a este tipo de columnas implica el uso de un elevado pH (en torno a 11) ya que a este pH se produce la unión efectiva de la iminobiotina a la avidina puesto que la base libre de la iminobiotina es la que es reconocida por la avidina (Cf. Green, N. M., 1966, Biochem. J., vol 101, pp. 774-780). La elución en este tipo de columnas se produce a pH 4.

Otras estrategias propuestas han sido el uso de otros derivados de biotina como la destiobiotina, cuya menor afinidad por la unión a avidina permite su desplazamiento por biotina sin modificar (Cf. Hirsch, J. D. et al., 2002, Anal. Biochem., vol 308, pp. 343-357). De cualquier manera, clásicamente en la purificación de avidina siguen empleándose columnas de iminobiotina y el rendimiento típico de las mismas es de aproximadamente un 90% con una capacidad de unión de aproximadamente 0.75 mg de avidina por mL de resina empleada (Cf. Heney, G. et al., 1981, Anal. Biochem., vol. 114, pp. 92-96). En muchas ocasiones, aunque la purificación se basa fundamentalmente en una etapa de afinidad se incorporan etapas adicionales como una precipitación previa con sulfato amónico o un intercambio iónico posterior a la cromatografía de afinidad.

Actualmente existen en el mercado diferentes soportes biotinilados siendo los más extendidos los basados en agarosa y sefarosa. De forma análoga, la biotina y compuestos relacionados han sido unidos covalentemente a una variedad de superficies, fundamentalmente de vidrio, oxido de silicio, polímeros y oro. La unión covalente de biotina a estos sólidos o superficies es llevada a cabo usando derivados activos de la biotina y soportes o superficies funcionalizadas complementariamente tanto a través de métodos químicos como fotoquímicos. La mayoría de los derivados activados de biotina usan la cadena lateral del ácido valérico para incorporar distintos grupos que no interfieren en la unión con la avidina y sus homólogos. Entre los más usados se encuentran esteres activados derivados de N-hidroxisuccinimida, maleimida derivado, el iodoacetil derivado, el piridil disulfuro derivado, el hidrazido derivado y otros derivados conteniendo grupos fotoactivables que son anclados a los soportes o superficies a través de uniones de tipo amida, tioeter, disulfuro o hidrazona fundamentalmente (cf. Smith, C. L., et al., 2006, Top. Curr. Chem. Vol 261, pp. 63-90).

La cicloadición de alquinos y azidas (Reacción de Huisgen) (Cf. R. Huisgen, In 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry (Ed.: A. Padwa), Willey, New York, 1984, pp. 1-176) se ha establecido recientemente como una importante herramienta sintética dentro del concepto de "click-chemistry" (cf. Kolb H. C. et al. 2001, Angew Chem Int Ed, vol. 40, pp. 2005) especialmente desde el descubrimiento de su catálisis regioselectiva y a temperatura ambiente mediante Cu(I) (cf. Rostovtsev, V. V. et al. 2002, Angew. Chem. Int. Ed., vol. 41, pp. 2596; Tornøe, C. W. et al. 2002, J. Org. Chem., vol. 67, pp. 3057-3064; WO03101972 A1). Las principales ventajas de esta reacción son la fácil introducción de grupos azido y alquino en los sustratos y la estabilidad de ambas funciones que toleran agua y oxigeno, y que permiten el ensamblaje modular de diferentes moléculas. La formación de los triazoles resultante de la fusión de ambas funciones es irreversible y normalmente transcurre con muy altos rendimientos. Debido a estas notables características, se han desarrollado una gran cantidad de aplicaciones en ciencia biomédica, síntesis orgánica y ciencia de los materiales mediante el uso de la "click-chemistry" (cf. Wang, Q. et al. 2005, Lett. Org. Chem., vol. 2, pp. 293-301; Kolb, H. C. et al. 2003, Drug Discov. Today, vol. 8, pp. 1128-1137; Bock, V. D., et al. 2005, Eur. J. Org. Chem., pp. 51-68; Lutz, J.F. 2007, Angew. Chem. Int. Ed. vol. 46, pp.1018-1023). En particular, la funcionalización de soportes basados en gel de...

1. Compuesto que comprende:

a. biotina o cualquiera de sus derivados de fórmula general (I);

b. un "linker" o enlazante que comprende el grupo 1,2,3-triazol; y

c. un soporte poroso.

donde:

X es S, el grupo SO₂ ó no existe;

Y es O ó NH;

Z es CH₂ ó CH₃ cuando X no existe.

R¹ es O ó NH; y

R² es un grupo seleccionado de entre un alquilo C₁-C₁₀, (CH₂CH₂O)_nCH₂, donde n tiene un valor de 0 a 10, ó (CH₂)₄CH(NH₂)COOCH₂.

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde X es S.

3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde Y es O.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R¹ es NH.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R² es CH₂.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el enlazante tiene la fórmula general (II) ó (III):

donde:

R³ es un alquilo C₁-C₁₀ ó un grupo seleccionado de entre (CH₂CH₂O)_nCH₂, donde n tiene un valor de 0 a 10, o (CH₂)₄CH(NH₂)COOCH₂;

R⁴ se selecciona del grupo que comprende O, C(O)R¹, R¹C(O)R¹ o R¹C(S)R¹ (donde R¹ es O ó NH); y

m tiene el valor de 1 a 11.

7. Compuesto según la reivindicación 6, donde m tiene el valor de 1 a 3.

8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde R³ es CH₂.

9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el soporte poroso es sílice.

10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, de fórmula (VI):

11. Procedimiento de obtención de un compuesto descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende los siguientes pasos:

a) funcionalización del soporte poroso usando un compuesto que comprende un grupo terminal azido (N₃) ó alquino (C=CH).

b) funcionalización de biotina o cualquiera de sus derivados con un grupo terminal alquino (C=CH) ó azido (N₃);

c) reacción del soporte funcionalizado del paso (a) con la biotina funcionalizada o cualquiera de sus derivados funcionalizados del paso (b) por reacción de cicloadición 1,3-dipolar ("click-chemistry").

12. Procedimiento según la reivindicación 11, donde la reacción de cicloadicción se produce entre un grupo azido del soporte poroso funcionalizado y un grupo alquino de la biotina funcionalizada.

13. Uso de un compuesto descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la purificación de avidina.

14. Uso de un compuesto descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la inmovilización de avidina.

15. Complejo que comprende un compuesto descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y avidina.

16. Uso del complejo descrito en la reivindicación 15, para la purificación de ligandos biotinilados.

17. Uso del complejo descrito en la reivindicación 15, para el marcaje fluorescente de avidina.