Forma humanizada de un anticuerpo anti-c-met murino que comprende:

(a) por lo menos una secuencia HVR seleccionada del grupo que consiste en:

(i)HVR-L1 que comprende la secuencia A1-A17, donde A1-A17 es KSSQSLLYTSSQKNYLA,

(ii)HVR-L2 que comprende la secuencia B1-B7, donde B1-B7 es WASTRES,

(iii)HVR-L3 que comprende la secuencia C1-C9, donde C1-C9 es QQYYAYPWT,

(iv)HVR-H1 que comprende la secuencia D1-D10, donde D1-D10 es GYTFTSYWLH, y

(v)HVR-H2 que comprende la secuencia E1-E18, donde E1-E18 es GMIDPSNSOTRFNPNFKD; y

(b) una variante HVR-H3 que comprende la secuencia TYRSYVTPLDY, SYRSYVTPLDY, TYSSYVTPLDY, SYSSYVTPLDY, TYSSYVTSLDY o TYSSYVTALDY

donde la afinidad monovalente de dicho anticuerpo a c-met humana es mayor que la afinidad monovalente de un anticuerpo murino que comprende una secuencia variable de cadena ligera mostrada en la SEC ID NO: 9 y una secuencia variable de cadena pesada mostrada en la SEC ID NO: 10 y donde dicho anticuerpo inhibe la proliferación celular dependiente de c-met mejor que un anticuerpo de referencia que comprende un anticuerpo c-met quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y una de cadena pesada mostrada en las SEC ID NO:9 y 10 respectivamente

Antagonistas anti-c-met humanizados.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a los campos de la biología molecular y la regulación de los factores de crecimiento. Más específicamente, la presente invención se refiere a moduladores del mecanismo de señalización HGF/c-met y usos de dichos moduladores.

Antecedentes

HGF es un factor pleiotrófico derivado del mesénquima con actividades mitogénica, motogénica y morfogénica en un conjunto de tipos de células diferentes. Los efectos del HGF están mediados por una tirosina quinasa específica, c-met, y a expresión aberrante de HGF y c-met se observa frecuentemente en un conjunto de tumores. Véase, por ejemplo, Maulik et al., Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59; Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7):863-867. La regulación del mecanismo de señalización HGF/c-Met está implicada en la progresión de tumores y metástasis. Véase, por ejemplo, Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300).

El HGF se une al dominio extracelular del receptor tirosina quinasa (RTK) de Met y regula diversos procesos biológicos, tal como la dispersión, proliferación y supervivencia celular. La señalización HGF-Met es esencial para el desarrollo embrionario normal especialmente en la migración de células progenitoras musculares y el desarrollo del hígado y el sistema nervioso (Bladt et al., 1995; Hamanoue et al., 1996; Maina et al., 1996; Schmidt et al., 1995; Uehara et al., 1995). Los fenotipos del desarrollo de ratones exentos de Met y HGF son muy similares, lo que sugiere que HGF es el ligando afín para el receptor de Met (Schmidt et al., 1995; Uehara et al., 1995). HGF-Met juega también un papel en la regeneración del hígado, angiogénesis y curación de heridas (Bussolino et al., 1992; Matsumoto y Nakamura, 1993; Nusrat et al., 1994). El receptor de Met precursor experimenta una separación proteolítica en una subunidad a extracelular y una subunidad ß que comprende la membrana unidos por enlaces disulfuro (Tempest et al., 1988). La subunidad ß contiene el dominio quinasa del citoplasma y alberga un sitio de interacción para múltiples sustratos en el extremo C-terminal donde proteínas adaptadoras se unen e inician la señalización (Bardelli et al., 1997; Nguyen et al., 1997; Pelicci et al., 1995; Ponzetto et al., 1994; Weidner et al., 1996). Tras la unión a HFG, la activación de Met conduce a la fosforilación de tirosina y la señalización cascada abajo a través de la activación de PI3-quinasa y ras/MAPK mediada por Gab1 y Grb2/Sos, respectivamente, lo cual conduce a la motilidad y proliferación celular (Furge et al., 2000; Hartmann et al., 1994; Ponzetto et al., 1996; Royal and Park, 1995).

Se observó que Met era transformante en una línea celular de osteosarcoma tratada con carcinógeno (Cooper et al., 1984; Park et al., 1986). Se ha observado la sobreexpresión o amplificación génica de Met en un conjunto de cánceres humanos. Por ejemplo, la proteína Met se sobreexpresa por lo menos 5 veces en cánceres colorrectales y se describe que se amplifica génicamente en la metástasis de hígado (Di Renzo et al., 1995; Liu et al., 1992). También se describe que la proteína Met se sobreexpresa en el carcinoma de célula escamosa oral, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células renales, carcinoma de mama, y carcinoma de pulmón (Jin et al., 1997; Morello et al., 2001; Natali et al., 1996; Olivero et al., 1996; Suzuki et al., 1994). Además, se ha observado la sobreexpresión de ARNm en carcinoma hepatocelular, carcinoma gástrico, y carcinoma colorrectal (Boix et al., 1994; Kuniyasu et al., 1993; Liu et al., 1992).

Se han encontrado un conjunto de mutaciones en el dominio quinasa de Met en carcinoma papilar renal que conduce a la activación constitutiva del receptor (Olivero et al., 1999; Schmidt et al., 1997; Schmidt et al., 1999). Estas mutaciones activantes confieren una fosforilación de tirosina de Met constitutiva y dan lugar a la activación de MAPK, la formación de focos y la tumorigénesis (Jeffers et al., 1997). Además, estas mutaciones aumentan la motilidad y la invasión celular (Giordano et al., 2000; Lorenzato et al., 2002). La activación de Met dependiente de HGF en células transformadas media en e aumento de la motilidad. La dispersión y la migración que finalmente conducen al crecimiento del tumor invasivo y la metástasis. (Jeffers et al., 1996; Meiners et al., 1998).

Se ha observado que Met interacciona con otras proteínas que impulsan al activación, transformación e invasión del receptor. En células neoplásicas, se describe que Met interacciona con la integrina a6ß4, un receptor para componentes de la matriz extracelular (ECM), tales como lamininas, para inducir el crecimiento invasivo dependiente de HGF (Trusolino et al., 2001). Además, se ha observado que el dominio extracelular de Met interacciona con un miembro de la familia de las semaforinas, plexina B1, y aumenta el crecimiento invasivo (Giordano et al., 2002). Además, también se describe que CD44v6, que se ha implicado en la tumorigénesis y metástasis, forma un complejo con Met y HGF y da lugar a la activación del receptor de Met (Orian-Rousseau et al., 2002).

Met es un miembro de a subfamilia de RTKs que incluyen Ron y Sea (Maulik et al., 2002). La predicción de la estructura del dominio extracelular de Met sugiere una homología compartida con las semaforinas y plexinas. El extremo N-terminal de Met contiene un dominio Sema de aproximadamente 500 aminoácidos que se conserva en todas las semaforinas y plexinas. Las semaforinas y plexinas pertenecen a una gran familia de proteínas secretadas y unidas a membrana descritas por primera vez por su papel en el desarrollo neuronal (Van Vactor and Lorenz, 1999). Sin embargo, más recientemente se ha correlacionado la sobreexpresión de semaforinas con la invasión tumoral y la metástasis. Un dominio PSI rico en cisteína (también referido como dominio de la Secuencia Relacionada con Met) hallado en plexinas, semaforinas e integrinas se encuentra adyacente al dominio Sema seguido de cuatro repeticiones IPT que son regiones de tipo inmunoglobulina halladas en plexinas y factores de transcripción. Un estudio reciente sugiere que el dominio Sema de Met es suficiente para la unión de HGF y heparina (Gherardi et al., 2003). Además, Kong-Beltran et al. (Cancer Cell (2004), 6:61-73) han descrito que el dominio Sema de Met es necesario para la dimerización y activación del receptor.

Se han descrito numerosas moléculas dirigidas al mecanismo HGF/c-met. Estas moléculas incluyen anticuerpos, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 5,686,292. También se ha observado que una parte del dominio extracelular de c-met es capaz de producir efectos antagonísticos contra el mecanismo HGF/c-met. En vista del importante papel que este mecanismo juega en la etiología de diversas condiciones patológicas, sin embargo, está claro que aún existe la necesidad de agentes que tienen características clínicas que son óptimas para el desarrollo como agentes terapéuticos. La invención descrita aquí cumple esta necesidad y proporciona otras ventajas.

Descripción de la invención

La invención está basada en parte en la identificación de un conjunto de antagonistas del mecanismo biológico HGF/c-met, que es un proceso biológico/celular que se presenta como una diana terapéutica importante y ventajosa. La presente invención proporciona composiciones y usos médicos tal como se define en las reivindicaciones en base a la interferencia con la activación de HFG/c-met, incluyendo, pero sin limitación, la interferencia con la unión de HGF a la parte extracelular de c-met y la multimerización del receptor. Los antagonistas de la invención, tal como se describen aquí, proporcionan importantes dianas terapéuticas y de diagnóstico para su uso en el reconocimiento de condiciones patológicas asociadas con una señalización anormal o no deseada del mecanismo HGF/c-met. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos y usos médicos tal como se definen en las reivindicaciones, y se refiere a kits y artículos de fabricación, relacionados con la modulación del mecanismo HGF-c-met, incluyendo la modulación de la unión del ligando de c-met, la dimerización de c-met, la activación y otras actividades biológicas/fisiológicas...

1. Forma humanizada de un anticuerpo anti-c-met murino que comprende:

(a) por lo menos una secuencia HVR seleccionada del grupo que consiste en:

(b) una variante HVR-H3 que comprende la secuencia TYRSYVTPLDY, SYRSYVTPLDY, TYSSYVTPLDY, SYSSYVTPLDY, TYSSYVTSLDY o TYSSYVTALDY

donde la afinidad monovalente de dicho anticuerpo a c-met humana es mayor que la afinidad monovalente de un anticuerpo murino que comprende una secuencia variable de cadena ligera mostrada en la SEC ID NO: 9 y una secuencia variable de cadena pesada mostrada en la SEC ID NO: 10 y donde dicho anticuerpo inhibe la proliferación celular dependiente de c-met mejor que un anticuerpo de referencia que comprende un anticuerpo c-met quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y una de cadena pesada mostrada en las SEC ID NO:9 y 10 respectivamente.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde por lo menos una parte de la secuencia del armazón es una secuencia del armazón consenso humana.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende una variante HVR-L2 que tiene la secuencia mostrada como SEC ID NO: 72.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende una variante HVR-H2 que tiene la secuencia mostrada como SEC ID NO: 98.

5. Anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende una HVR-L1 que tiene la secuencia de SEC ID NO: 1.

6. Anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende una HVR-L3 que tiene la secuencia de SEC ID NO: 3.

7. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde la variante HVR-H3 comprende la secuencia TYRSYVTPLDY, TYSSYVTPLDY, TYSSYVTSLDY o TYSSYVTALDY.

8. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde la afinidad monovalente del anticuerpo con respecto a c-met humana es por lo menos 3 veces superior a la afinidad monovalente de un anticuerpo murino que comprende una secuencia variable de cadena ligera y una de cadena pesada mostradas en las SEC ID NO: 9 y 10 en la figura 7.

9. Anticuerpo humanizado según la reivindicación 1, donde el anticuerpo murino se produce mediante la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de acceso de la American Type Culture Collection ATCC con la designación HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6).

10. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde la afinidad de unión se expresa como un valor Kd.

11. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1,8 ó 9, donde la afinidad de unión se mide mediante Biacore o radioinmunoensayo.

12. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende la secuencia del armazón consenso del subgrupo 1 ? humana.

13. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende la secuencia del armazón consenso del subgrupo III de cadena pesada humana.

14. Anticuerpo según la reivindicación 13, donde la secuencia armazón comprende una sustitución en la posición 71, 73 y/o 78.

15. Anticuerpo según la reivindicación 14, donde dicha sustitución es R71A, N73T y/o N78A.

16. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo humanizado inhibe la unión del factor de crecimiento de hepatocitos humano a su receptor mejor que un anticuerpo de referencia que comprende un anticuerpo quimérico anti-c-met que comprende una secuencia variable de cadena ligera y una de cadena pesada mostradas en las SEC ID NO: 9 y 10, respectivamente.

17. Anticuerpo según la reivindicación 16, donde el anticuerpo inhibe la unión con un valor IC50 que es inferior que la mitad del del anticuerpo quimérico.

18. Anticuerpo según la reivindicación 17, donde la IC50 se determina a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo desde aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 1000 nM.

19. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo humanizado inhibe la activación del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) humano mejor que un anticuerpo de referencia que comprende un anticuerpo anti-c-met quimérico que comprende una secuencia variable de cadena ligera y una de cadena pesada mostradas en las SEC ID NO: 9 y 10, respectivamente.

20. Anticuerpo según la reivindicación 19, donde el anticuerpo inhibe la activación del receptor con un valor de IC50 que es inferior a la mitad del del anticuerpo quimérico.

21. Anticuerpo según la reivindicación 20, donde la IC50 se determina a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM.

22. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo humanizado inhibe la proliferación celular con un valor de IC50 que es inferior a la mitad del del anticuerpo quimérico.

23. Anticuerpo según la reivindicación 22, donde la IC50 se determina a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 100 nM.

24. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico son monovalentes.

25. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde tanto el anticuerpo humanizado como el anticuerpo quimérico comprenden una región Fab única unida a una región Fc.

26. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias HVR1-HC, HVR2-HC y HVR3-HC mostradas como SEC ID NO: 191-193, respectivamente.

27. Anticuerpo según la reivindicación 26, donde el dominio variable comprende las secuencias FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y FR4-HC mostradas como SEC ID NO: 187-190, respectivamente.

28. Anticuerpo según la reivindicación 26 ó 27, donde el anticuerpo comprende un CH1 y/o Fc mostrados como SEC ID NO: 194 y 195, respectivamente.

29. Anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias HVR1-LC, HVR2-LC y HVR3-LC mostradas como SEC ID NO: 183-185, respectivamente.

30. Anticuerpo según la reivindicación 29, donde el dominio variable comprende las secuencias FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC y FR4-LC mostradas como SEC ID NO: 179-182, respectivamente.

31. Anticuerpo según la reivindicación 29 ó 30, donde el anticuerpo comprende la secuencia de CL1 mostrada como SEC ID NO: 186.

32. Anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 y un dominio variable de cadena ligera según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31.

33. Anticuerpo según la reivindicación 32, que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende las secuencias HVR1-HC, HVR2-HC y HVR3-HC mostradas como SEC ID NO: 191-193, respectivamente, las secuencias FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC y FR4-HC mostradas como SEC ID NO: 187-190, respectivamente, y un CH1 y Fc mostrados como SEC ID NO: 194 y 195, respectivamente, y un dominio variable de cadena ligera que comprende las secuencias HVR1-LC, HVR2-LC y HVR3-LC mostradas como SEC ID NO: 183-185, respectivamente, las secuencias FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC y FR4-LC mostradas como SEC ID NO: 179-182, respectivamente, y la secuencia de CL1 mostrada como SEC ID NO: 186.

34. Anticuerpo según la reivindicación 32 ó 33, donde el anticuerpo es monovalente y comprende una región Fc.

35. Anticuerpo según la reivindicación 34, donde la región Fc comprende un primer y un segundo polipéptido, donde el primer y segundo polipéptido comprenden cada uno una o más mutaciones con respecto a Fc humana de tipo salvaje.

36. Anticuerpo según la reivindicación 35, donde el primer polipéptido comprende la secuencia Fc mostrada como SEC ID NO: 195 y el segundo polipéptido comprende la secuencia mostrada como SEC ID NO: 196.

37. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método de tratamiento.

38. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método de tratamiento del cáncer.

39. Anticuerpo según la reivindicación 38, donde el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y/o cáncer pancreático.

40. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno proliferativo.

41. Uso del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

42. Uso según la reivindicación 41, donde el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y/o cáncer pancreático.

43. Uso del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno proliferativo.

44. Ácido nucleico que codifica el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-36.

45. Célula huésped que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 44.

46. Composición que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-36.

47. Composición según la reivindicación 46, donde la composición comprende un portador.