ANALISIS MATEMATICO PARA LA ESTIMACION DE CAMBIOS EN EL NIVEL DE EXPRESION GENICA.

Un método para calcular indicios de diferencias en el nivel de expresión génica en una pluralidad de hibridaciones de matrices,

comprendiendo el método:

(a) determinar una indicación del ruido experimental asociado con la intensidad de la señal de hibridación para un gen en cada hibridación de matrices;

(b) usar la indicación del ruido experimental determinada para determinar una función de distribución de probabilidad analítica que describe los valores de distribución de la intensidad para el gen en cada hibridación de matrices aplicando el Teorema de Bayes;

(c) usar las funciones de distribución de probabilidad analíticas para derivar una función de distribución de probabilidad conjunta analítica que describe relaciones posibles o factores de cambio para un gen expresado de manera diferencial en dicha pluralidad de hibridaciones de matrices; y

(d) aplicar la función de distribución de probabilidad conjunta del gen expresado de manera diferencial usando las intensidades y valores de ruido derivados experimentalmente de las hibridaciones de matrices, para determinar los valores relacionados con el factor de cambio en el nivel de expresión del gen expresado de manera diferencial

Análisis matemático para la estimación de cambios en el nivel de expresión génica.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un análisis matemático para la estimación cuantitativa del nivel de expresión génica diferencial. Más específicamente, la presente invención se refiere a la derivación matemática de una distribución a posteriori de todos los factores de cambio del nivel de expresión génica que pueden inferirse de las mediciones experimentales dadas.

Las células dependen de sus numerosos componentes proteicos para una amplia variedad de funciones. Estas funciones incluyen, p.ej., la producción de energía, la biosíntesis de todas las macromoléculas que la componen, el mantenimiento de la arquitectura celular, la capacidad de actuar frente a estímulos intra- y extracelulares, y similares. Cada célula dentro de un organismo contiene en ella la información necesaria para producir el repertorio de proteínas que ese organismo puede expresar. Esta información se almacena como genes en el genoma del organismo. El número de genes humanos únicos se estima que es de 30.000 a 100.000.

Para una célula dada, sólo una porción de la serie de genes se expresa en forma de proteína. Lo más probable es que algunas proteínas estén presentes en todas las células (esto es, se expresan de manera ubicua) porque cumplen función(es) biológica(s) que se requieren en todos los tipos de célula, y pueden parecer como proteínas "gobernantas". Por el contrario, otras proteínas cumplen funciones especializadas que se requieren sólo en tipos celulares particulares. Por ejemplo, las células musculares contienen proteínas especializadas que forman las densas fibras contráctiles de un músculo. Dado que una gran parte de la funcionalidad específica de una célula está determinada por los genes que está expresando, es lógico que la transcripción, el primer paso en el proceso de convertir la información genética almacenada en el genoma de un organismo en proteína, estuviera altamente regulada por la red de control que coordina y dirige la actividad celular.

La regulación de la expresión génica se observa fácilmente en estudios que examinan actividades evidentes en células que se configuran a sí mismas para una función en particular (p.ej., la especialización en una célula muscular) o estado (p.ej., multiplicación activa o inactividad). Por consiguiente, según las células alteran su situación, puede observarse la transcripción coordinada de la(s) proteína(s) que se requieren para este "estado" biológico/fisiológico molecular. Este conocimiento global, altamente detallado, del estado transcripcional de la célula proporciona información sobre la situación de la célula, así como sobre el/los sistema(s) biológico(s) que controlan esta situación. Por ejemplo, el conocimiento de cuándo y en qué tipos de células se expresa el producto proteico de un gen de función desconocida proporcionaría pistas útiles en cuanto a la función probable de ese gen. La determinación de los patrones de expresión génica en células normales podría proporcionar un conocimiento detallado de la forma en la que el sistema de control consigue la activación y desactivación altamente coordinadas requeridas para el desarrollo y diferenciación de un organismo maduro a partir de una única célula huevo fertilizada. La comparación de los patrones de expresión génica en células normales y patológicas podría proporcionar "huellas" de diagnóstico útiles y ayudar a identificar funciones aberrantes que serían dianas razonables para una intervención terapéutica.

Lamentablemente, la capacidad para llevar a cabo estudios en los que se determine el estado transcripcional de un gran número de genes ha estado, hasta hace poco, inhibida por limitaciones en la capacidad para examinar las células con respecto a la presencia y abundancia de un gran número de productos de transcripción génica en un único experimento. Una limitación puede estar en el pequeño número de genes identificados. En el caso de los humanos, sólo unos pocos miles de proteínas codificadas en el genoma humano se han purificado físicamente y caracterizado cuantitativamente hasta algún punto. Otra limitación puede estar en la forma de los análisis de transcripción.

Dos abordajes con avances tecnológicos recientes han ayudado a los análisis de transcripción génica. La clonación de moléculas derivadas de productos de transcripción de tipo mARN en tejidos particulares, y a continuación la aplicación de la secuenciación de alto rendimiento para los extremos de ADN de los miembros de estas genotecas ha proporcionado un catálogo de etiquetas de secuencias expresadas (ESTs, del inglés "expressed sequence tags"). Véase, p.ej., Boguski y Schuler, Nat. Genetics 10: 369-370 (1995). Estas "secuencias firma" pueden proporcionar identificadores inequívocos para una gran cohorte de genes.

Además, los clones de los que derivaron estas secuencias proporcionan reactivos analíticos que pueden usarse en la cuantificación de productos de transcripción de muestras biológicas. Los polímeros de ácido nucleico, ADN y ARN, se sintetizan biológicamente en una reacción de copia en la que un polímero sirve como molde para la síntesis de una cadena opuesta, que se denomina su complementaria. Después de la separación de las cadenas una de la otra (esto es, la desnaturalización), puede inducirse que estas cadenas se apareen, bastante específicamente, con otras cadenas de ácido nucleico que poseen una secuencia complementaria, en un proceso denominado hibridación. Esta unión específica puede ser la base de los procedimientos analíticos para medir la cantidad de una especie en particular de ácido nucleico, tal como el mARN que especifica un producto génico de una proteína en particular.

Un segundo avance implica la tecnología de micromatrices/microensayos. Este es un procedimiento basado en la hibridación que permite la cuantificación simultánea de muchas especies de ácido nucleico. Véase, p.ej., DeRisi et al., Nat. Genetics 14: 457-460 (1996), Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619 (1996). Esta técnica combina la colocación robótica (esto es, la aplicación de manchas ("spotting")) de pequeñas cantidades de especies de ácido nucleico puras individuales sobre una superficie de vidrio, la hibridación de esta matriz con múltiples ácidos nucleicos marcados con fluorescencia, y la detección y cuantificación de los híbridos marcados con fluorescencia resultantes con, por ejemplo, un microscopio confocal de barrido. Cuando se usa para detectar productos de transcripción, un producto de transcripción de tipo ARN particular (esto es, un mARN) puede copiarse para convertirlo en ADN (esto es, un cADN) y esta forma copiada del producto de transcripción se inmoviliza subsiguientemente sobre, por ejemplo, una superficie de vidrio.

Un problema en el análisis de los datos de expresión génica es la estimación del factor de cambio global en el nivel de expresión de un gen en un experimento con relación a su expresión en otro experimento. Dadas estas dos mediciones brutas del factor de cambio en el nivel de expresión génica, el enfoque más simple, tal como se ha utilizado en metodologías anteriores, ha sido tomar la relación aritmética de los valores como un valor estimado del factor de cambio global. Mientras que para señales muy fuertes esto conduce a un valor estimado significativo del factor de cambio en las concentraciones de mARN subyacentes, para señales más débiles los resultados son mucho más ambiguos debido a la contaminación por el "ruido" que es autóctono para el sistema experimental particular utilizado. Otra tecnología anteriormente utilizada para la estimación del factor de cambio en el nivel de expresión génica se basa en intensidades de señal diferentes (p.ej., el chip Affymetrix®). Sin embargo, los valores asignados a los niveles de expresión usando la metodología anteriormente mencionada pueden ser negativos, conduciendo así a la situación delicada de relaciones de expresión génica negativas o indefinidas.

El documento WO-A-99/54724 describe un procedimiento analítico para discriminar datos adquiridos a partir de muestras con distribuciones que solapan, y para mejorar y evaluar la validez estadística de la señal de hibridación en matrices de ensayos. El procedimiento incluye un método para convolucionar datos en dos o más funciones de densidad de probabilidad discretas que representan señal y no señal, flujos discretos u otras variables independientes convolucionadas. El sistema usa las funciones de densidad de...

1. Un método para calcular indicios de diferencias en el nivel de expresión génica en una pluralidad de hibridaciones de matrices, comprendiendo el método:

        (a)        determinar una indicación del ruido experimental asociado con la intensidad de la señal de hibridación para un gen en cada hibridación de matrices;

        (b)        usar la indicación del ruido experimental determinada para determinar una función de distribución de probabilidad analítica que describe los valores de distribución de la intensidad para el gen en cada hibridación de matrices aplicando el Teorema de Bayes;

        (c)        usar las funciones de distribución de probabilidad analíticas para derivar una función de distribución de probabilidad conjunta analítica que describe relaciones posibles o factores de cambio para un gen expresado de manera diferencial en dicha pluralidad de hibridaciones de matrices; y

        (d)        aplicar la función de distribución de probabilidad conjunta del gen expresado de manera diferencial usando las intensidades y valores de ruido derivados experimentalmente de las hibridaciones de matrices, para determinar los valores relacionados con el factor de cambio en el nivel de expresión del gen expresado de manera diferencial.

2. El método de la reivindicación 1, en el que los valores determinados incluyen los factores de cambio estimados en la concentración de los productos de transcripción génica.

3. El método de la reivindicación 2, en el que los valores determinados incluyen un medidor de la calidad asociado con al menos uno de los factores de cambio estimados.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el medidor de la calidad representa al menos una de una probabilidad de que un factor de cambio pudiera ser menor que 1 cuando un factor de cambio estimado es mayor que 1, y una probabilidad de que un factor de cambio sea mayor que 1 cuando el factor de cambio estimado es menor que 1.

5. El método de la reivindicación 1, en el que los valores determinados incluyen los límites de confianza sobre el factor de cambio dados intervalos de confianza específicos.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la función de distribución de probabilidad analítica se define suponiendo que el ruido es gaussiano.

7. Un producto programa de ordenador, para calcular indicios de diferencias en el nivel de expresión génica en una pluralidad de hibridaciones de matrices, que reside en un medio legible en ordenador, y que comprende instrucciones que hacen al ordenador:

        (a)        determinar una indicación del ruido experimental asociado con la intensidad de la señal de hibridación para un gen en cada hibridación de matrices;

        (b)        usar la indicación del ruido experimental determinada para determinar una función de distribución de probabilidad analítica que describe los valores de distribución de la intensidad para el gen cada hibridación de matrices aplicando el Teorema de Bayes;

        (c)        usar las funciones de distribución de probabilidad analíticas para derivar una función de distribución de probabilidad conjunta analítica que describe relaciones posibles o factores de cambio para un gen expresado de manera diferencial en dicha pluralidad de hibridaciones de matrices; y

        (d)        aplicar la función de distribución de probabilidad conjunta del gen expresado de manera diferencial usando las intensidades y valores de ruido derivados experimentalmente de las hibridaciones de matrices, para determinar los valores relacionados con el factor de cambio en el nivel de expresión del gen expresado de manera diferencial.

8. El producto programa de ordenador de la reivindicación 7, en el que los valores determinados incluyen los factores de cambio estimados en la concentración de los productos de transcripción génica.

9. El producto programa de ordenador de la reivindicación 8, en el que los valores determinados incluyen un medidor de la calidad asociado con al menos uno de los factores de cambio estimados.

10. El producto programa de ordenador de la reivindicación 9, en el que el medidor de la calidad representa al menos una de una probabilidad de que un factor de cambio pudiera ser menor que 1 cuando un factor de cambio estimado es mayor que 1, y una probabilidad de que un factor de cambio sea mayor que 1 cuando el factor de cambio estimado es menor que 1.

11. El producto programa de ordenador de la reivindicación 7, en el que los valores determinados incluyen los límites de confianza sobre el factor de cambio dados intervalos de confianza específicos.

12. El método de la reivindicación 1, en el que se determina una indicación del ruido experimental, se determina la función de distribución de probabilidad, y se deriva la función de distribución de probabilidad conjunta y se aplica para cada gen en cada hibridación de matrices.

13. El producto programa de ordenador de la reivindicación 7, en el que las instrucciones para hacer al ordenador determinar una indicación de ruido experimental, determinar la función de distribución de probabilidad, derivar la función de distribución de probabilidad conjunta, y aplicar la función de distribución de probabilidad conjunta, hacen que el ordenador lo haga para cada gen en cada hibridación de matrices.

14. El producto programa de ordenador de la reivindicación 7, en el que la función de distribución de probabilidad analítica se determina suponiendo que el ruido es gaussiano.