Acidos nucleicos y alérgenos del polen de olivo de variedades definidas de olivo y aplicaciones.

Se han aislado, caracterizado e identificado ácidos nucleicos que codifican péptidos, o fragmentos de los mismos, que comprenden, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 de polen de olivo de variedades definidas de olivo (Olea europea L.). Dichos péptidos, que poseen uno o más epítopos alergénicos del alérgeno mayoritario del polen de olivo (Ole e 1) tienen actividad alergénica y pueden ser utilizados, entre otras aplicaciones, en el diagnóstico y tratamiento de la alergia al polen de olivo. Dicha actividad alergénica de dichos péptidos o fragmentos de los mismos puede ser modulada mediante la introducción de modificaciones apropiadas con el fin de obtener variantes hiopoalergénicas o hiperalergénicas. El empleo de alérgenos recombinantes específicos de variedades definidas de olivo permite, además determinar perfiles individualizados de reactividad para cada paciente y el diseño deinmunoterapias personalizadas

Ácidos nucleicos y alérgenos del polen de olivo de variedades definidas de olivo y aplicaciones.

Campo de la invención

La invención se relaciona con ácidos nucleicos que codifican péptidos que comprenden, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 de polen de olivo de una variedad definida de olivo (Olea europea L.). La invención también se relaciona con los péptidos resultantes de la expresión de dichos ácidos nucleicos y con las aplicaciones de dichos ácidos nucleicos y péptidos con fines de diagnóstico y tratamiento de la alergia al polen de olivo, entre otras aplicaciones.

Antecedentes de la invención

El olivo (Olea europaea L.) es uno de los cultivos de mayor importancia en el área Mediterránea, donde ha sido cultivado durante milenios. El cultivo extensivo de esta planta ha conducido a la aparición de un germoplasma extremadamente amplio y variado, con al menos 262 cultivares identificados solamente en España. Hasta muy recientemente, la caracterización de los cultivares de olivo se ha realizado primariamente de acuerdo a parámetros morfológicos y agronómicos. Sin embargo, está emergiendo la utilización de técnicas moleculares con la finalidad de hacer esta caracterización varietal mucho más fiable, rápida y sencilla.

El polen del olivo es uno de los más importantes agentes causales de fenómenos de alergia estacional en humanos, más concretamente de las alergias de tipo I, en aquellos países en los que esta planta está ampliamente distribuida. El alérgeno mayoritario de este polen (denominado Ole e 1) es una proteína de 20 kDa que ha sido aislada, secuenciada, clonada y expresada en Escherichia coli [Lauzurica et al. Olive (Olea europaea) pollen allergens I. Immunochemical characterization by immunoblotting, CRIE and immunodetection by a monoclonal antibody. Mol. Immunol. 1988; 25: 329-335; Lauzurica et al. Olive (Olea europaea) pollen allergens II. Isolation and characterization of two major antigens. Mol Immunol. 1988; 25: 337-344; Villalba et al. Isolation of three allergenic fractions of the major allergen from Olea europaea pollen and N-terminal amino acid sequence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; 172:523-528; Villalba et al. The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen. Eur J Biochem 1993; 216: 863-869; Villalba et al. Cloning and expression of Ole e 1, the major allergen from olive tree pollen. J Biol Chem 1994; 269:15217-15222; Martín-Orozco et al. Ole e 1: epitope mapping, cross-reactivity with other Oleaceae pollens and ultrastructural localization. Int. Arch. Allergy Immunol. 1994; 104: 160-170; Lombardero et al. cDNA sequence analysis of the main olive allergen, Ole e I. Clin Exp Allergy 1994; 24:765-770; Batanero et al. Glycosylation site of the major allergen from olive tree. Allergenic implications of the carbohydrate moiety. Mol. Immunol. 1994; 31: 31-37; Batanero et al. IgE binding and histamine-release capabilities of the main carbohydrate component isolated from the major allergen of olive tree pollen. J. Allergy Clin. Immunol. 1999; 103:147-153].

Ole e 1 consiste en una sola cadena polipeptídica de 145 aminoácidos que presenta diversas formas de glicosilación que incluyen fundamentalmente una forma no-glicosilada de 18,4 kDa, una forma glicosilada de 20 kDa, una forma hiperglicosilada de 22 kDa y otra variante de 40 kDa compuesta de dímeros de la forma glicosilada [Villalba et al. The amino acid sequence of Ole e 1, the major allergen from olive tree (Olea europaea) pollen. Eur J Biochem 1993; 216: 863-869; Villalba et al. Cloning and expression of Ole e 1, the major allergen from olive tree pollen. J Biol Chem 1994; 269:15217-15222]. La secuencia de Ole e 1 presenta una homología relevante (24-34%) con otras proteínas del polen de maíz, tomate, centeno, abedul, arroz, Arabidopsis etc. Esta identidad aumenta a un 85% cuando se compara con proteínas análogas a Ole e 1 de otros miembros de la familia Oleaceae (Fraxinus excelsior, Ligustrum vulgaris, Syringa vulgare, Forsithya suspensa). El propio Ole e 1 muestra también microheterogeneidades en diversas posiciones de su secuencia aminoacídica. Además de la proteína alergénica Ole e 1, están siendo caracterizadas muchas otras proteínas del polen del olivo (Ole e 2, Ole e 3, ... y sucesivamente hasta Ole e 10) capaces de unirse a anticuerpos IgE humanos, y, por tanto, catalogadas como alérgenos:

Ole e 2: Asturias et al. Cloning and expression of the panallergen profilin and the major allergen (Ole e 1) from olive tree pollen. J Allergy Clin Immunol. 1997 Sep; 100(3):365-72; Martinez et al. The allergenic relevance of profilin (Ole e 2) from Olea europaea pollen. Allergy. 2002;57 Suppl 71:17-23;

Ole e 3: Batanero et al. Isolation, cDNA cloning and expression of Lig v 1, the major allergen from privet pollen. Clin Exp Allergy. 1996; 26(12):1401-10; Ledesma et al. Molecular cloning and expression of active Ole e 3, a major allergen from olive-tree pollen and member of a novel family of Ca²⁺-binding proteins (polcalcins) involved in allergy. Eur J Biochem. 1998; 258(2):454-459;

Ole e 4 y Ole e 5: Boluda et al. Purification, characterization, and partial sequencing of two new allergens of Olea europaea. J Allergy Clin Immunol. 1998 Feb; 101(2 Pt 1):210-6; Carnes & Fernandez-Caldas. Ole e 4 and Ole e 5, important allergens of Olea europaea. Allergy. 2002; 57 Suppl 71:24-28;

Ole e 5: Alché et al. Superoxide dismutase isoenzymes of olive pollen. Physiol. Plantarum 104, 772-776. 1998;

Ole e 6: Batanero et al. Purification, amino acid sequence and immunological characterization of Ole e 6, a cysteine-enriched allergen from olive tree pollen. FEBS Lett. 1997 Jun 30;410 (2-3):293-6;

Ole e 7: Florido Lopez et al. An allergen from Olea europaea pollen (Ole e 7) is associated with plant-derived food anaphylaxis. Allergy. 2002; 57 Suppl 71:53-9; Tejera et al. Identification, isolation, and characterization of Ole e 7, a new allergen of olive tree pollen. J Allergy Clin Immunol. 1999; 104:797-802;

Ole e 8: Ledesma A, Villalba M, Vivanco F, Rodriguez R. Olive pollen allergen Ole e 8: identification in mature pollen and presence of Ole e 8-like proteins in different pollens. Allergy. 2002 Jan; 57(1):40-3;

Ole e 9: Palomares et al. The C-terminal segment of the 1,3-beta-glucanase Ole e 9 from olive (Olea europaea) pollen is an independent domain with allergenic activity: expression in Pichia pastoris and characterization. Biochem J. 2003; 369:593-601; Huecas et al. Ole e 9, a major olive pollen allergen is a 1,3-beta-glucanase. Isolation, characte- rization, amino acid sequence, and tissue specificity. J Biol Chem. 2001; 276(30):27959-66. Epub 2001 May 23; y

Ole e 10: Barral et al. A major allergen from pollen defines a novel family of plant proteins and shows intra- and interspecie cross-reactivity. J Immunol. 2004; 172(6):3644-3651.

Tanto la diagnosis como el tratamiento de la alergia al polen del olivo se basan actualmente en la utilización de extractos proteicos obtenidos a partir de dicho polen, mediante diversos procedimientos. Los extractos obtenidos tienen que ser estandarizados según recomendaciones de la OMS a través de la Unión Internacional de Sociedades de Inmunología, Subcomité de Estandarización de Alérgenos (WHO Expert Committee on Biological Standardisation. Guidelines for the preparation and establishment of reference materials and reference reagents for biological substances. WHO Technical Report Series No. 626, 1978). Dicha organización mantiene diversos patrones, aunque los fabricantes de extractos poseen patrones internos para su propia referencia.

Diversos trabajos científicos están caracterizando la presencia de elevada variabilidad en el contenido alergénico del polen del olivo (y en consecuencia en los extractos producidos a partir de dicho polen) proveniente de diversas distribuciones geográficas, y concretamente de distintas variedades de esta planta. Debido a que la alergenicidad depende del material usado en inmunoterapia, el cual varía según la variedad de la que proceda el polen, se ha prestado gran atención a la tecnología del ADN recombinante como una alternativa viable a la producción de alérgenos recombinantes, facilitando así su caracterización a nivel molecular, y su uso en...

1. Un ácido nucleico que codifica un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 de polen de olivo de una variedad definida de olivo (Olea europea L.), en donde dicho ácido nucleico se selecciona entre:

2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicha variedad definida de olivo se selecciona entre las variedades denominadas Picholine, Menara, Lucio, Picual, Loaime, Hojiblanca, Arbequina y Bella de España.

3. Una construcción génica que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, operativamente unido a una secuencia de control de la expresión.

4. Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o una construcción génica según la reivindicación 3.

5. Un sistema de expresión que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, una construcción génica según la reivindicación 3 o un vector recombinante según la reivindicación 4.

6. Un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 de polen de olivo de una variedad definida de olivo (Olea europea), en donde dicho péptido tiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

7. Péptido según la reivindicación 6, en el que dicha variedad definida de olivo se selecciona entre las variedades denominadas Picholine, Menara, Lucio, Picual, Loaime, Hojiblanca, Arbequina y Bella de España.

8. Péptido según la reivindicación 6 ó 7, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 y un fragmento de las mismas.

9. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende una modificación que afecta:

10. Péptido según la reivindicación 9, en el que:

11. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que dicho péptido es una variante hipoalergénica del mismo.

12. Un procedimiento para la producción de un péptido que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 de polen de olivo de una variedad definida de olivo (Olea europea) según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, que comprende la expresión de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, contenida en un sistema de expresión según la reivindicación 5, bajo condiciones que permiten la expresión de dicha secuencia de nucleótidos y la producción de dicho péptido y, si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar dicho péptido.

13. Un anticuerpo caracterizado porque es capaz de unirse a un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11.

14. Anticuerpo según la reivindicación 13, en el que la secuencia aminoacídica de dicho péptido comprende, o está constituida por, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 27-50, o un fragmento de las mismas que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 de polen de olivo.

15. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo totalmente humano, un anticuerpo no humano, o un fragmento de los mismos que comprende, al menos, un epítopo del alérgeno Ole e 1 de polen de olivo.

16. Un soporte sólido que comprende:

17. Soporte según la reivindicación 16, en el que dichos ácidos nucleicos, péptidos o anticuerpos están inmovilizados y dispuestos en dicho soporte sólido en una disposición orientada y ordenada.

18. Soporte según la reivindicación 16 ó 17, que comprende, al menos, un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

19. Soporte según la reivindicación 16 ó 17, que comprende, al menos, un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11.

20. Soporte según la reivindicación 16 ó 17, que comprende, al menos, un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.

21. Una composición farmacéutica que comprende, como sustancia activa, al menos, un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, o, al menos, un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.

22. Composición farmacéutica según la reivindicación 21, en donde dicha composición farmacéutica es una vacuna destinada a inmunoterapia frente a la alergia al polen de olivo.

23. Composición farmacéutica según la reivindicación 21 ó 22, que comprende, además, un vehículo, un excipiente, un diluyente, un adyuvante, un retardante y/o un estabilizante, farmacéuticamente aceptables.

24. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, que comprende, además, una sustancia activa adicional.

25. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, en la que dicha sustancia activa adicional comprende un agente antihistamínico, una hormona esteroidea, un antagonista de receptores de histamina, leucotrienos, alergoides y mezclas de los mismos.

26. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en una formulación en micropartículas, nanopartículas o liposomas.

27. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, en una forma farmacéutica de administración sólida, en una forma farmacéutica de administración líquida, o en una forma farmacéutica de administración que comprende un sistema disperso.

28. Composición farmacéutica según la reivindicación 27, en una forma farmacéutica de administración seleccionada entre soluciones inyectables, polvos, gránulos, perlas, comprimidos, cápsulas, jarabes, emulsiones, supositorios, colirios, nebulizaciones, aerosoles, cremas, geles y formas farmacéuticas de administración sublinguales.

29. Empleo de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, o, de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la elaboración de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo.

30. Empleo según la reivindicación 29, en el que dicha composición farmacéutica es una vacuna destinada a inmunoterapia.

31. Un reactivo para su empleo en un método in vitro o in vivo para el diagnóstico de alergia a polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, en donde dicho reactivo comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, o un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.

32. Empleo de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, o de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la elaboración de una composición para el diagnóstico in vivo de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto.

33. Un método in vitro para (i) el diagnóstico de alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (ii) determinar la evolución del curso de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (iii) evaluar la eficacia de un tratamiento contra alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, que comprende determinar el título de IgE y, opcionalmente, IgG, frente a un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 en una muestra biológica de dicho sujeto.

34. Empleo de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 en un método in vitro para (i) el diagnóstico de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (ii) determinar la evolución del curso de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto, o para (iii) evaluar la eficacia de un tratamiento contra alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto.

35. Un kit para la puesta en práctica de un método según la reivindicación 33 que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 o un soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones 16, 17 ó 19.

36. Un kit para la puesta en práctica de un método para el diagnóstico in vivo de la alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo en un sujeto que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, o un soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones 16, 17, 19 ó 20.

37. Empleo de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 para la identificación in vitro de la reacción celular al alérgeno Ole e 1 de polen de olivo de una variedad definida de olivo, mediante la estimulación o inhibición de dicha reacción celular.

38. Empleo de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para obtener productos derivados de dichos ácidos nucleicos, potencialmente útiles en investigación, diagnóstico, terapia y/o prevención de alergia al polen de olivo y/o en la caracterización de cultivares de olivo.

39. Empleo según la reivindicación 38, en el que dichos productos derivados de dichos ácidos nucleicos comprenden sondas DNA opcionalmente marcadas, sondas RNA opcionalmente marcadas, vacunas DNA, construcciones antisentido, construcciones hipoalergénicas o hiperalergénicas modificadas, construcciones para la sobreexpresión del alérgeno recombinante, o construcciones de "knocking out" de genes de alérgenos.

40. Empleo de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 para obtener productos derivados de dichos péptidos, potencialmente útiles en investigación, diagnóstico, terapia y/o prevención de alergia al polen de olivo y/o en la caracterización de cultivares de olivo.

41. Empleo según la reivindicación 40, en el que dichos productos derivados de dichos péptidos comprenden oligómeros de dichos péptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos que reconocen epítopos de dichos péptidos o mimotopos.

42. Un método in vitro para identificar el alérgeno del polen de la variedad de olivo (Olea europea) causante de alergia en un sujeto o para identificar la variedad de olivo (Olea europea) causante de alergia en un sujeto que comprende:

43. Método según la reivindicación 42, en el que dicha pluralidad de péptidos comprende, además, péptidos que comprenden al menos, un epítopo de un alérgeno de polen de olivo específico de una variedad definida de olivo, en donde dicho alérgeno de polen de olivo se selecciona entre los alérgenos Ole e 2, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10 y sus mezclas.

44. Método según la reivindicación 43, en el que dicha variedad definida de olivo se selecciona entre las variedades de olivo denominadas Picholine, Menara, Lucio, Picual, Loaime, Hojiblanca, Arbequina y Bella de España.

45. Método según la reivindicación 43 o 44, en el que dicha pluralidad de péptidos comprende, al menos, un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11.

46. Método según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45 que comprende, antes de la etapa a), la etapa de poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con una mezcla de alérgenos de polen de olivo.

47. Método según la reivindicación 46, en el que dicha mezcla de alérgenos de polen de olivo comprende un extracto proteico de polen de olivo de cualquier variedad de olivo.

48. Método según la reivindicación 46, en el que dicha mezcla de alérgenos de polen de olivo contiene dos o más péptidos comprendiendo cada uno de dichos péptidos, al menos, un epítopo de un alérgeno de polen de olivo específico de una variedad definida de olivo.

49. Método según la reivindicación 48, en el que dicho alérgeno de polen de olivo se selecciona entre los alérgenos Ole e 1, Ole e 2, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10 y sus mezclas.

50. Un método para diseñar una terapia personalizada para un sujeto que padece alergia al polen de olivo de una variedad definida de olivo que comprende:

en donde la identificación del alérgeno del polen de la variedad de olivo o de la variedad de olivo causante de alergia en dicho sujeto se lleva a cabo mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 48.