PROCEDIMIENTO DE COMPROBACIÓN Y CONTROL DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO EN MAMÍFEROS/RUTA METABÓLICA DE FERMENTACIÓN AEROBIA DE LA GLUCOSA EN EL ORGANISMO DE MAMÍFEROS.

El uso de la enzima TKTL1 como molécula indicadora y diana para la detección cualitativa y cuantitativa del grado de uso y del flujo correcto del proceso de la ruta metabólica de la fermentación aerobia de la glucosa en mamíferos (aGF-mam) en un individuo mamífero (paciente),

caracterizado porque en una muestra biológica obtenida de dicho individuo (paciente) se realizan las siguientes etapas: - determinación (i) de la actividad y/o la concentración de la proteína TKTL1 o determinación de la actividad y/o la concentración del gen de TKTL1 o del ARNm de TKTL1 dentro de dicha muestra de dicho individuo (paciente) y dentro de una muestra de control y/o determinar (ii) la localización celular y/o el estado de agregación y/o el estado de dimerización de la proteína TKTL1 dentro de dicha muestra de dicho individuo (paciente) y dentro de una muestra de control, - comparación de los datos determinados obtenidos de dicha muestra de dicho individuo (paciente) con los datos obtenidos de la muestra de control, y - toma (i) de un nivel potenciado o disminuido del nivel de actividad y/o de concentración de la proteína TKTL1 o del gen de TKTL1 o del ARNm de TKTL1 en dicha muestra del individuo en comparación con la muestra de control como una indicación de un grado del uso potenciado o disminuido de la ruta metabólica de fermentación aerobia de la glucosa en mamíferos, respectivamente, y (ii) una localización celular anómala y/o un estado de agregación anómalo y/o un estado de dimerización anómalo de la proteína TKTL1 en dicha muestra del individuo en comparación con la muestra de control como una indicación de una ruta metabólica de fermentación aerobia de la glucosa en mamíferos

Se divulga un procedimiento para la detección cualitativa y cuantitativa del proceso de fermentación del ácido láctico en mamíferos o ruta metabólica de fermentación aerobia de glucosa, respectivamente, en un individuo mamífero (paciente, organismo de mamíferos).

La divulgación se basa en el nuevo descubrimiento científico, de que (1) en el organismo de mamíferos -es decir en células de mamíferos-también existe una ruta del metabolismo, hasta ahora solo conocida en células procariotas (por ejemplo en lactobacillus), comprendiendo dicha ruta del metabolismo la degradación de glucosa en lactato con producción de energía, aunque exista y se encuentre biodisponible suficiente oxígeno (molecular) libre, es decir, existan condiciones aerobias y que (2) la enzima TKTL1 es la enzima indicadora de dicho nuevo metabolismo de fermentación de la glucosa.

En caso de falta de oxígeno, las células de mamíferos pueden degradar la glucosa en ácido láctico lo que conduce en última instancia a mialgias. Esta degradación anaerobia de la glucosa se realiza mediante la ruta de Embden-Meyerhorf. En los años 1920 Otto Warburg descubrió que las células de mamíferos también podían degradar la glucosa en ácido láctico en presencia de suficientes cantidades de oxígeno disponibles, es decir, que las células de mamíferos podían fermentar la glucosa en ácido láctico incluso en presencia de suficientes cantidades de oxígeno libre biodisponible. Observó esta ruta de degradación anaerobia de glucosa en lactato en presencia de oxígeno en tejidos tumorales así como en determinados tejidos sanos como retina y testículos. Por razones históricas esta degradación de glucosa en lactato incluso en presencia de oxígeno se denomina glucólisis aerobia o efecto Warburg. Dado que el punto de inicio y fin (glucosa y lactato) es el mismo que el de la fermentación de glucosa en lactato en ausencia de oxígeno mediante la ruta de Embden-Meyerhof, la producción de lactato se ha interpretado como el resultado de la ruta de Embden-Meyerhof. Sin embargo, durante los experimentos que conducen a la presente invención resulta evidente que es la transcetolasa TKTL1 la que permite la degradación de la glucosa o la fermentación de la glucosa, respectivamente, en lactato incluso en presencia de oxígeno y que esta ruta de la glucosa es significativamente diferente a la de la ruta de Embden-Meyerhof.

El gen de transcetolasa TKTL1 se ha descubierto hace algunos años, concretamente en 1996 por Coy y col. (Genomics 32, 309-316). Debido a un codón de terminación en un exón de codificación previsto, se comentó el gen de transcetolasa TKTL1 como un pseudogen en las bases de datos de secuencias. A pesar de esto, en el año 2002 Coy demostró que el gen de TKTL1 codifica una transcetolasa enzimáticamente activa. La transcetolasa TKTL1 es filogenéticamente afín con las otras dos transcetolasas humanas conocidas TKT y TKTL2. Sin embargo, diferentes genes codifican las tres enzimas transcetolasas, de manera que para la TKT el gen se localiza en el cromosoma 3, para la TKTL2 el gen se localiza en el cromosoma 4 y para la TKTL1 el gen se localiza en la banda Xq28 del cromosoma X en seres humanos.

Una de las funciones más importantes de la enzima TKTL1 en células de mamífero es su función catalizadora durante la fermentación de glucosa en ácido láctico en presencia de oxígeno, es decir en condiciones aerobias. La TKTL1 es la enzima indicadora en la nueva ruta metabólica, denominada de fermentación aerobia de la glucosa en mamíferos descubierta recientemente en primer lugar o proceso de fermentación del ácido láctico en mamíferos, respectivamente. A continuación esta ruta recientemente descubierta recibe el nombre de ruta metabólica de fermentación aerobia de la glucosa o de manera abreviada aGF-mam, respectivamente.

Los detalles de esta aGF-mam son los siguientes:

Un complejo de proteína que contiene TKTL1 y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPD) que permite una degradación no oxidativa de la glucosa. La transferencia de electrones no implica a las mitocondrias y permite la producción de ATP independiente de mitocondrias en células que expresan TKTL1. La aplicación de compuestos anti-TKTL1 o análogos inhibidores de tiamina o parabenzoquinonas (o derivados de benzoquinonas) puede aplicarse para la inhibición de dicha producción de ATP independiente de mitocondrias (en particular, por ejemplo, en tumores con un metabolismo de azúcar basado en TKTL1).

Usando la proteína TKTL1 humana el autor de la invención de la presente solicitud de patente confirmó la formación de gliceraldehído-3-fosfato en una reacción uni-sustrato usando X5P como única fuente de carbono.

El metabolismo de TKTL1 mediante X5P da como resultado la formación de acetil-CoA. La degradación anaerobia de la glucosa en condiciones aerobias conduce a lactato y a la acumulación de energía rica en el compuesto acetil-CoA. Después, el complejo piruvato deshidrogenasa, por ejemplo, se inhibe por acetil-CoA, y como consecuencia, el piruvato se reduce principalmente a lactato.

En las Figuras 13 y 14 se proporciona una descripción esquemática de la aGF-mam completa.

Los detalles en relación con la enzima indicadora TKTL1 de esta aGF-mam son los siguientes: Durante los experimentos que conducen a la presente invención se identificaron diferentes isoformas de TKTL1 a nivel de proteína usando un nuevo anticuerpo monoclonal (Linaris Biologische Produkte GmbH, Wertheim) que detecta específicamente la proteína TKTL1.

Las isoformas de la proteína TKTL1 son parte de un complejo multiproteína. Dentro de este complejo TKTL1 también se une a proteínas no relacionadas con transcetolasa como gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), DNasaX (DNasa 1 -de tipo 1), Akt (= proteína quinasa B); histonas, histona deacetilasa, proteína precursora amiloidea y proteínas de unión a actina.

Las transcetolasas conocidas son homodímeros de dos proteínas de longitud completa que contienen todos los restos aminoacídicos de transcetolasa invariantes típicos. Las isoformas de la proteína TKTL1 codificadas por el gen de tipo transcetolasa constituyen homo/heterodímeros de TKTL1 y heterodímeros de TKT/TKTL1 o TKTL2/TKTL1. La expresión de isoformas de la proteína TKTL1 incluso una isoforma enzimáticamente no activa-ejerce influencia sobre la actividad enzimática de una proteína TKT o TKTL2 como parte de un heterodímero TKT/TKTL1 o TKTL2/TKTL1. Un cambio molecular y una conexión de protón sincronizan los sitios activos en homo-y heterodímeros de TKT/TKTL1, TKTL2/TKTL1 y TKTL1/TKTL1.

La demostración de que el gen de TKTL1 (mM_012253; Números de acceso: X91817; BC025382) codifica una proteína transcetolasa de longitud completa así como isoformas más pequeñas de la proteína tiene importantes implicaciones en la investigación fundamental y salud médica.

Además de sus funciones enzimáticas, las proteínas de TKTL1 muestran diversas funciones diferentes dependiendo de la localización de las proteínas en las células de mamíferos y de su estado de agregación. En células de mamíferos la proteína TKTL1 se localiza principalmente en el citoplasma, pero también aparece en el núcleo. Dentro del citoplasma la función principal de la TKTL1 es la catálisis de la reacción (trans)cetolasa. Otras funciones de las proteínas TKTL1 localizadas dentro del núcleo se asocian con el control del ciclo celular y la mitosis, con el control de la transcripción (del propio gen de TKTL1 y otros) y con la regulación de la apoptosis.

El documento EP 1 354 961 divulga el uso de TKTL1 como marcador para tumores.

Las proteínas TKTL1 (cuyas funciones dependen de su localización o del estado de agregación) se denominan proteínas “pluriempleadas”, ya que ejecutan diferentes funciones dependiendo de la localización subcelular, del tipo de célula así como de su estado de agregación.

El objeto de la presente invención se basa en poner a disposición un procedimiento para una detección (y control) cualitativa y cuantitativa del grado (nivel) de uso y del flujo correcto del proceso (normal, natural) de la ruta metabólica de fermentación aerobia de la glucosa en mamíferos (aGF-mam) en un individuo mamífero, es decir un procedimiento para controlar si este proceso de metabolismo/ruta se desarrolla realmente en las células investigadas del organismo mamífero apropiado, si se diera el caso en que grado y si se desarrolla “normal” o correcto, respectivamente o si se producen... [Seguir leyendo]

1. El uso de la enzima TKTL1 como molécula indicadora y diana para la detección cualitativa y cuantitativa del grado de uso y del flujo correcto del proceso de la ruta metabólica de la fermentación aerobia de la glucosa en mamíferos (aGF-mam) en un individuo mamífero (paciente), caracterizado porque en una muestra biológica obtenida de dicho individuo (paciente) se realizan las siguientes etapas:

- determinación (i) de la actividad y/o la concentración de la proteína TKTL1 o determinación de la actividad y/o

la concentración del gen de TKTL1 o del ARNm de TKTL1 dentro de dicha muestra de dicho individuo (paciente)

y dentro de una muestra de control y/o determinar (ii) la localización celular y/o el estado de agregación y/o el

estado de dimerización de la proteína TKTL1 dentro de dicha muestra de dicho individuo (paciente) y dentro de

una muestra de control,

- comparación de los datos determinados obtenidos de dicha muestra de dicho individuo (paciente) con los

datos obtenidos de la muestra de control, y

- toma (i) de un nivel potenciado o disminuido del nivel de actividad y/o de concentración de la proteína TKTL1 o

del gen de TKTL1 o del ARNm de TKTL1 en dicha muestra del individuo en comparación con la muestra de

control como una indicación de un grado del uso potenciado o disminuido de la ruta metabólica de fermentación

aerobia de la glucosa en mamíferos, respectivamente,

y (ii) una localización celular anómala y/o un estado de agregación anómalo y/o un estado de dimerización anómalo de la proteína TKTL1 en dicha muestra del individuo en comparación con la muestra de control como una indicación de una ruta metabólica de fermentación aerobia de la glucosa en mamíferos.

2. El uso de la reivindicación 1 para la detección y supervisión de una enfermedad asociada con una potenciación o disminución y/o anomalía de la ruta metabólica de fermentación aerobia de la glucosa en mamíferos

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se realiza durante un procedimiento de formación de imágenes molecular in vivo o in vitro.

4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra biológica es una muestra de tejido, una biopsia, un fluido corporal, una secreción, un frotis, suero, orina, semen, heces, bilis, un líquido que contiene células, células sometidas a lisis, restos de células , péptidos o ácidos nucleicos.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la determinación se realiza a nivel de la proteína, es decir siendo la diana la proteína TKTL1.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la determinación a nivel de la proteína se realiza usando una molécula que se une específicamente a la proteína TKTL1.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha molécula es un anticuerpo dirigido contra TKTL1 o un fragmento de dicho anticuerpo anti-TKTL1 o un peptidomimético que comprende un epítopo de unión a antígeno o un mini-anticuerpo.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la determinación se realiza a nivel del ácido nucleico es decir siendo la diana el gen de TKTL1 o el ARNm de TKTL1.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que para la determinación se usa al menos una sonda de ácido nucleico que puede hibridarse con el gen de TKTL1 o con un ARNm de TLTL1.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en el que para la determinación se usa un ácido nucleico quimérico que comprende un ácido nucleico TKTL1.